冷凍電子顯微技術(shù)
——2017年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)成果簡析

馬成英 高寧

2017年10月4日，諾貝爾獎(jiǎng)組委會(huì)宣布將諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予瑞士洛桑大學(xué)的Jacques Dubochet、美國哥倫比亞大學(xué)的Joachim Frank和英國MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Richard Henderson，以表彰這3位科學(xué)家在冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展中做出的重大貢獻(xiàn)。

1 冷凍電鏡技術(shù)的起源和發(fā)展

結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)中的重要研究手段，通過解析生物大分子的高分辨三維結(jié)構(gòu)理解它們之間如何互相作用，如何發(fā)揮各自的生物學(xué)功能。冷凍電鏡、X射線晶體學(xué)（X-ray crystallography）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）構(gòu)成了解析蛋白質(zhì)高分辨結(jié)構(gòu)的3種主要結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段。冷凍電鏡，即冷凍電子顯微技術(shù)（cryo-electron microscopy，cryo-EM），是在低溫狀態(tài)下，通過使用透射電子顯微鏡觀察冷凍樣品的一種顯微技術(shù)。根據(jù)樣品處理方式的不同，冷凍電鏡技術(shù)又可以分為電子晶體學(xué)、單顆粒重構(gòu)技術(shù)和電子掃描斷層成像技術(shù)。伴隨冷凍電鏡硬件設(shè)備的發(fā)展和計(jì)算方法的改進(jìn)，利用單顆粒重構(gòu)技術(shù)已經(jīng)獲得了大量的高分辨的蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)。更為重要的是，這一方法可以解析傳統(tǒng)的蛋白晶體學(xué)和NMR技術(shù)難以處理的復(fù)雜生物樣品的高分辨結(jié)構(gòu)，例如分子量相對較大的多亞基分子機(jī)器、膜蛋白復(fù)合物等。

電子顯微鏡誕生于20世紀(jì)30年代，隨后被廣泛的應(yīng)用到生物樣品的二維形態(tài)表征中，很多重要的細(xì)胞生物學(xué)發(fā)現(xiàn)（例如細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器）都是采用這一顯微技術(shù)。與此同時(shí)，也正是在X射線的晶體學(xué)技術(shù)的黃金發(fā)展時(shí)期，一整套的衍射理論和數(shù)據(jù)處理方法被逐漸建立。20世紀(jì)60年代，英國MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Aaron Klug嘗試了將晶體學(xué)的理論和方法用于電子顯微鏡所拍攝圖片的處理，首次建立了基于電子顯微鏡所采集數(shù)據(jù)的三維重構(gòu)技術(shù)。在這篇標(biāo)志著“電鏡三維技術(shù)”誕生的劃時(shí)代論文當(dāng)中，Klug和他的學(xué)生David DeRosier使用重金屬離子（比如醋酸鈾）對蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，然后再使用透射電鏡進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，通過分析具有螺旋對稱性的T4噬菌體尾巴的電子衍射花樣，從而重構(gòu)出其三維結(jié)構(gòu)。這一早期的三維重構(gòu)技術(shù)被稱為電子晶體學(xué)，這種技術(shù)要求樣品具有一定的周期性（對稱性），從而能夠產(chǎn)生特定的高信噪比的衍射花樣。電子晶體學(xué)方法隨后被用于多種生物樣品的結(jié)構(gòu)解析，例如螺旋結(jié)構(gòu)的樣品、病毒和二維晶體等。例如，1975年，Henderson和Unwin利用電子晶體學(xué)解析了分辨率為7 ?的第一個(gè)膜蛋白的三維結(jié)構(gòu)：具有7次跨膜螺旋的細(xì)菌視紫紅質(zhì)結(jié)構(gòu)。Klug因其在電子晶體學(xué)的奠基性貢獻(xiàn)榮獲1982年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

電子晶體學(xué)法在膜蛋白結(jié)構(gòu)解析上的一個(gè)比較大的挑戰(zhàn)就是需要獲得比較規(guī)則的二維晶體。而高質(zhì)量的二維晶體樣品的獲取在實(shí)驗(yàn)上非常困難，這也導(dǎo)致了電子晶體學(xué)的廣泛應(yīng)用受到了限制。另外一個(gè)限制因素是負(fù)染染料會(huì)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成破壞，而且大顆粒的重金屬染料也會(huì)影響最終三維結(jié)構(gòu)的分辨率。1974年，Ken Taylor和Robert Glaeser利用冷凍的水化過氧化氫酶晶體獲得了高分辨電子衍射花樣，第一次在實(shí)驗(yàn)上證明低溫可以有效的保持生物樣品的完整性及降低電子輻照損傷。接下來，Dubochet等在1980年發(fā)展了利用液態(tài)乙烷冷凍生物樣品并獲得玻璃態(tài)冰的方法，電子顯微技術(shù)從此進(jìn)入了“冷凍”時(shí)代。這一冷凍技術(shù)很快在電子晶體學(xué)應(yīng)用中帶來重大突破。例如，借助樣品冷凍，Henderson等在1990年將細(xì)菌視紫紅質(zhì)的分辨率提升到了3.5 ?。一些其它的重要生物大分子復(fù)合物也通過電子晶體學(xué)的方法獲得了原子分辨率的結(jié)構(gòu)，如植物捕光復(fù)合物、微管蛋白二聚體，及分辨率高達(dá)1.9 ?的水通道蛋白AQP0。

在電子晶體學(xué)方法發(fā)展的同時(shí)，以Joachim Frank為代表的科學(xué)家另辟蹊徑，提出可以通過收集大量的“全同”的生物大分子的二維投影照片，在數(shù)據(jù)處理階段合并這些大量的不同投影方向的照片從而獲得三維結(jié)構(gòu)的方法。這一方法具有非常高的普適性，不需要生物樣品具有任何對稱性或者周期排列，其核心是可以通過計(jì)算機(jī)技術(shù)在數(shù)據(jù)處理過程中對二維投影照片進(jìn)行分類平均以提高信噪比。這一技術(shù)就是冷凍電鏡技術(shù)中目前應(yīng)用最為廣泛的單顆粒重構(gòu)技術(shù)。在1980—2010年間，多個(gè)研究組加入到單顆粒技術(shù)的方法開發(fā)中，誕生了一系列各有特長的數(shù)據(jù)處理軟件，包括SPIDER、IMAGIC、EMAN、XMIPP、FREALIGN、RELION等。自2013年以來，伴隨冷凍電鏡硬件設(shè)備和計(jì)算方法的改進(jìn)，單顆粒技術(shù)獲得了革命性的發(fā)展，已經(jīng)有大量的原子分辨率的結(jié)構(gòu)獲得解析。

2 3位獲獎(jiǎng)?wù)咴谶@一領(lǐng)域的突出貢獻(xiàn)

Jacques Dubochet生于1942年6月，1973年獲得日內(nèi)瓦大學(xué)和巴塞爾大學(xué)的生物物理學(xué)博士學(xué)位。1978年到1987年，作為組長任職于歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。1987—2007年，作為教授任職于瑞士洛桑大學(xué)。Dubochet發(fā)展了快速冷凍技術(shù)以觀察生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白復(fù)合物或者純化的生物樣品。其早期主要貢獻(xiàn)是建立了將蛋白周圍的水溶液快速冷凍并使蛋白分子狀態(tài)保持自然狀態(tài)的方法。這一基于液態(tài)乙烷和液氮進(jìn)行冷凍制樣并形成無定形冰（玻璃態(tài)冰）的方法一直沿用至今，在各種各樣的冷凍電鏡技術(shù)中扮演了非常重要的作用。Dubochet之后進(jìn)一步發(fā)展了各種冷凍技術(shù)用于細(xì)胞制樣，推動(dòng)冷凍制樣進(jìn)入了更廣泛的應(yīng)用。

Joachim Frank 1940年出生于德國，1970年在Walter Hoppe的指導(dǎo)下于慕尼黑工業(yè)術(shù)大學(xué)獲得博士學(xué)位，2006年當(dāng)選為選為美國藝術(shù)與科學(xué)、美國國家科學(xué)院兩院院士，目前是哥倫比亞大學(xué)生物化學(xué)與分子生物物理學(xué)系教授。Frank是目前冷凍電鏡三維重構(gòu)最常用的方法——單顆粒重構(gòu)技術(shù)的創(chuàng)始人。Frank發(fā)展了處理不同取向的單顆粒大分子復(fù)合物的二維投影的方法，提出了單顆粒重構(gòu)的思想，并開發(fā)了用于單顆粒三維重構(gòu)的一系列計(jì)算方法和相關(guān)軟件SPIDER。1975年，F(xiàn)rank認(rèn)識(shí)到“精確的發(fā)現(xiàn)并對位大量的模糊的單顆粒投影間的結(jié)構(gòu)特征”是這一方法的核心環(huán)節(jié)，并且在后續(xù)幾十年的工作中持之以恒解決一個(gè)個(gè)的技術(shù)困難，發(fā)展了一些列用于二維單顆粒投影的分類、平均、三維重構(gòu)的算法。同時(shí)，F(xiàn)rank最早利用冷凍電鏡解析了生物體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯機(jī)器核糖體的三維結(jié)構(gòu)，對于核糖體的結(jié)構(gòu)和功能的研究也做出了巨大貢獻(xiàn)。

Richard Henderson于1945年出生于蘇格蘭，MRC分子生物實(shí)驗(yàn)室教授，于1983年當(dāng)選英國皇家學(xué)會(huì)院士。1975年，Henderson與Unwin合作，利用電子晶體學(xué)首次獲得分辨率為7 ?的細(xì)菌視紫紅質(zhì)的結(jié)構(gòu)。這是首次觀測到膜蛋白的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，也是首次利用該技術(shù)看清楚蛋白樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)。1990年，經(jīng)過10多年的努力，Henderson通過冷凍制樣最終解析了冷凍狀態(tài)下的細(xì)菌視紫紅質(zhì)二維晶體結(jié)構(gòu)，這也是冷凍電鏡技術(shù)所獲得的第一個(gè)原子分辨率的結(jié)構(gòu)。除了這些早期的電子晶體學(xué)的貢獻(xiàn)，Henderson還在單顆粒技術(shù)發(fā)展的不同階段做出了重大的推動(dòng)性工作。他最早通過理論分析指出了單顆粒方法獲得原子分辨率結(jié)構(gòu)的各種限制因素，提出在合適的成像條件下，即使50 Kd大小的樣品的原子分辨率也可由數(shù)千張投影照片獲得。Henderson的另外一項(xiàng)重要貢獻(xiàn)是他和電鏡制造公司合作最早進(jìn)行了用于冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集的DDD相機(jī)的研發(fā)。目前冷凍電鏡高分辨數(shù)據(jù)的采集均使用DDD相機(jī)。

3 冷凍電鏡技術(shù)的研究進(jìn)展

近幾年來，伴隨硬件設(shè)備和計(jì)算方法的改進(jìn)，運(yùn)用冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)的方法能夠得到原子分辨率的三維模型，用來進(jìn)行生物大分子復(fù)合物組裝和功能的研究。冷凍電鏡三維重構(gòu)的基礎(chǔ)是基于收集大量的不同取向的投影圖片。最早冷凍電鏡的圖片是使用膠片來記錄，但是需要對膠片進(jìn)行顯影和數(shù)字化處理。隨后發(fā)展的CCD（charge-coupled device）相機(jī)能夠應(yīng)用于自動(dòng)化數(shù)據(jù)收集中，但是CCD采集照片首先是將電子信號(hào)轉(zhuǎn)變成光信號(hào)，然后再轉(zhuǎn)化成電信號(hào)進(jìn)行檢測，這一信號(hào)轉(zhuǎn)換過程導(dǎo)致高分辨信息的損失，影響最終的分辨率。近幾年來，冷凍電鏡領(lǐng)域發(fā)生了幾個(gè)重要的革命性的技術(shù)突破，最主要的是電子直接探測相機(jī)（DDD，directelection detector）的發(fā)明。目前使用的金屬氧化物半導(dǎo)體感光元件（CMOS）能夠在1 s內(nèi)獲得幾百張的圖片，通過對這些時(shí)序曝光的圖片進(jìn)行漂移的矯正和疊加，能夠大幅度的保持圖片中的高分辨信息。例如，UCSF的程亦凡組開發(fā)了對整個(gè)照片的frame進(jìn)行圖像漂移矯正的算法，并整合到了MotionCorr程序中，利用這些矯正算法，程亦凡和合作者David Julius組首次得到了分辨率為3.4 ?的膜蛋白TRPV1的三維結(jié)構(gòu)。而在新型的DDD出現(xiàn)之前，基于冷凍電鏡單顆粒技術(shù)所獲得的高分辨率的結(jié)構(gòu)只存在于高對稱性的生物樣品，其中代表性的科學(xué)家為UCLA的周正洪教授，他的課題組率先獲得了原子分辨率的病毒顆粒。

TRPV1高分辨結(jié)構(gòu)解析之后，隨著DDD相機(jī)在世界各電鏡中心的大范圍推廣，大量的近原子分辨率的結(jié)構(gòu)被解析出來，推動(dòng)了結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)革命。進(jìn)一步的最新發(fā)展包括相位板（例如Volta Phase Plate）技術(shù)，使許多小蛋白的結(jié)構(gòu)也能夠被解析出來。比如，Sexton等運(yùn)用B類GPCR-G蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，Danev等解析了分子量僅為64 kDa的分辨率為3.2 ?的血紅蛋白的結(jié)構(gòu)。此外，冷凍電鏡數(shù)據(jù)的高效分類算法也在這一輪技術(shù)革命中扮演了重要的不可缺少的角色，代表性人物為RELION的開發(fā)者SjorsScheres。

4 中國科研人員的相關(guān)研究情況

20世紀(jì)80年代，郭可信、李方華、馮瑞和王仁卉等中國科學(xué)家參與了早期生物電鏡技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。與此同時(shí)，國內(nèi)許多優(yōu)秀的青年科學(xué)家也積極到國外冷凍電鏡實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行學(xué)習(xí)。20世紀(jì)90年代，國內(nèi)的一些科研工作者也獨(dú)立開展了冷凍電鏡技術(shù)的研究，包括清華大學(xué)的隋森芳、中山大學(xué)的張景強(qiáng)及中國科學(xué)院生物物理研究所的徐偉。2008年，清華大學(xué)購買了國內(nèi)第一臺(tái)高端冷凍電鏡Titan Krios，隨后中國科學(xué)院生物物理研究所和國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（上海）也建立了以Titan Krios為核心的冷凍電鏡平臺(tái)，國內(nèi)的冷凍電鏡學(xué)科發(fā)展自此進(jìn)入了一個(gè)快速發(fā)展期。其中代表性的工作為2014年朱平組和李國紅組解析的30 nm染色體纖維結(jié)構(gòu)。2014年之后，由于冷凍電鏡的相機(jī)設(shè)備的升級(jí)，國內(nèi)多個(gè)研究組利用冷凍電鏡發(fā)表了優(yōu)秀的高水平的文章。例如，施一公組解析了mRNA剪切體的結(jié)構(gòu)，顏寧組解析了真核電壓門控的鈣離子通道結(jié)構(gòu)，楊茂君組解析了人源的呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物結(jié)構(gòu)，隋森芳組解析了海洋紅藻藻膽體的結(jié)構(gòu)，柳振峰組和章新政組解析了光系統(tǒng)II-捕光復(fù)合物II的超級(jí)復(fù)合體結(jié)構(gòu)，顏寧組和高福組合作解析了埃博拉病毒感染受體NPC1的結(jié)構(gòu)，高寧組獲得了核糖體組裝和翻譯調(diào)控復(fù)合物的高分辨結(jié)構(gòu)，王宏偉組獲得了RNA代謝相關(guān)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，尹長城組和孫飛組解析了開放態(tài)RyR1的結(jié)構(gòu)，葉克窮組解析了核糖體組裝前體相關(guān)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，張勤奮組和合作者對多種病毒的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，毛有東組解析了人源蛋白酶體26S的結(jié)構(gòu)，徐彥輝組解析了DNA依賴的蛋白激酶復(fù)合物結(jié)構(gòu)，向燁組利用冷凍電鏡和晶體學(xué)相結(jié)合的方法研究了噬菌體穿膜的機(jī)制，陳柱成組和李雪明組合作解析了染色質(zhì)重塑復(fù)合物Snf的結(jié)構(gòu)，柴繼杰組和隋森芳組解析了天然免疫通路的NLRC4多聚體結(jié)構(gòu)，叢堯組解析了蛋白質(zhì)折疊機(jī)器TriC/CCT等復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，陳雷組和高寧組合作解析了胰細(xì)胞來源的ATP敏感鉀離子通道結(jié)構(gòu)，蔡剛組解析了DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的激酶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。

同時(shí)，國內(nèi)的冷凍電鏡方法學(xué)也獲得了長足進(jìn)展。孫飛組和張法組長期合作，開發(fā)了一系列冷凍電鏡數(shù)據(jù)處理的軟件，李雪明組與曾堅(jiān)陽組開發(fā)了基于深度學(xué)習(xí)算法的顆粒挑選軟件，劉洪榮組和程凌鵬提出了新的病毒顆粒重構(gòu)算法，王宏偉組和雷建林合作實(shí)現(xiàn)了基于球差校正和相位板等新附件的數(shù)據(jù)收集新策略，王佳偉組開發(fā)了基于冷凍電鏡密度圖的自動(dòng)建模軟件。

近年來，國內(nèi)的冷凍電鏡發(fā)展進(jìn)入了快車道，眾多單位投入資金購置高端冷凍電鏡?？梢灶A(yù)期，在未來的幾年，會(huì)有一大批的具有國際影響力的方法學(xué)和應(yīng)用的研究成果涌現(xiàn)。?