冷凍電子顯微學(xué)
——2017年度諾貝爾化學(xué)獎成果簡析

王宏偉

2017年10月4日，諾貝爾化學(xué)獎評獎委員會宣布，將2017年的諾貝爾化學(xué)獎授予3位科學(xué)家，表彰他們在發(fā)展利用冷凍電子顯微學(xué)技術(shù)解析溶液中生物大分子高分辨率結(jié)構(gòu)方面做出的開創(chuàng)性貢獻(xiàn)。這3位科學(xué)家分別是瑞士洛桑大學(xué)教授Jacques Dubochet，美國哥倫比亞大學(xué)教授Joachim Frank以及英國MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室教授Richard Henderson。

1 冷凍電子顯微學(xué)的發(fā)展歷程

“Seeing is believing”。自從列文虎克發(fā)明光學(xué)顯微鏡以來，人類可以觀察生命體的微觀結(jié)構(gòu)，并促成了一系列生物學(xué)中的重要發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)代生物學(xué)的研究對微觀精細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察提出了更高的要求。這是因?yàn)?，生物體的各種生命活動的機(jī)制是由其組成成分之間的空間關(guān)系與變化情況決定的；對于細(xì)胞及生物大分子結(jié)構(gòu)的認(rèn)識和理解能夠讓研究者們對生命過程有更深層次的認(rèn)知。因而，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生物大分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)的揭示，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的本質(zhì)需求以及主要推動力。

光學(xué)顯微鏡受限于可見光波長的衍射極限，能夠?qū)崿F(xiàn)的分辨率有限，主要在200 nm附近。過去十幾年發(fā)展起來的超高分辨率光學(xué)顯微鏡技術(shù)已經(jīng)可以達(dá)到10 nm的分辨率，但是仍然無法看到分子內(nèi)的精細(xì)結(jié)構(gòu)。20世紀(jì)初，德國學(xué)者H.Busch提出可以利用電子束在電磁場中的偏轉(zhuǎn)性質(zhì)進(jìn)行成像，1931年德國科學(xué)家Ernst Ruska（1986年度諾貝爾物理學(xué)獎獲得者）發(fā)明了透射電子顯微鏡，開辟了應(yīng)用電子光源觀察微觀世界精細(xì)結(jié)構(gòu)的時(shí)代。在透射電子顯微鏡中，電子槍產(chǎn)生的電子在高壓電場中被加速至亞光速并在高真空的顯微鏡內(nèi)部運(yùn)動。根據(jù)高速運(yùn)動的電子在磁場中發(fā)生偏轉(zhuǎn)的原理，透射電子顯微鏡中的一系列電磁透鏡對電子進(jìn)行匯聚，并對穿透樣品過程中與樣品發(fā)生相互作用的電子進(jìn)行聚焦成像以及放大，最后在記錄介質(zhì)上形成樣品放大幾千倍至幾十萬倍的圖像，從而獲得樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)信息。

應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察生物樣品需要克服3個(gè)技術(shù)難點(diǎn)：1）高真空的顯微鏡內(nèi)部環(huán)境與生物樣品在水化環(huán)境中的矛盾；2）生物樣品主要由輕元素組成，易于受到高能電子的輻照損傷；3）生物樣品的輕元素組成與電子的相互作用較弱，導(dǎo)致成像的襯度低。在20世紀(jì)中葉，生物學(xué)家開發(fā)了一系列技術(shù)來繞過上述問題，通過對生物樣品進(jìn)行固定、包埋、切片以及重金屬染色等過程，使得應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)成為可能，并因此發(fā)現(xiàn)了許多重要的細(xì)胞器，如葉綠體、高爾基體、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜、中心體和細(xì)胞骨架等。但這樣制備的生物樣品都是處于脫水狀態(tài)的，是對附著于生物大分子表面的重金屬染料成像，而不是對生物大分子的直接成像，因此無法保持和獲得生物樣品中的生物大分子高分辨率結(jié)構(gòu)信息。

如何在透射電子顯微鏡內(nèi)觀察含水狀態(tài)的生物樣品并獲得高分辨率的結(jié)構(gòu)信息，成為20世紀(jì)70年代部分科學(xué)家試圖努力解決的科學(xué)問題。Donald Parsons提出應(yīng)用較低真空的樣品臺保持一定的水分從而在透射電鏡里觀察生物樣品。Richard Henderson與Nigel Unwin采用葡萄糖包埋技術(shù)替代水分首次解析了細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白二維晶體的7 ?分辨率的三維結(jié)構(gòu)。Robert Glaeser與Kenneth Taylor發(fā)現(xiàn)將catalase蛋白的薄晶體冷凍在近液氮溫度下，可以大大減少電子的輻照損傷，保持了蛋白質(zhì)的高分辨率結(jié)構(gòu)信息。Jacques Dubochet研究組根據(jù)Robert Glaeser實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的原理對快速冷凍水溶液的過程進(jìn)行了深入的研究，發(fā)明了將含有生物大分子的溶液迅速冷凍于液氮溫度下的實(shí)用技術(shù)，并首次在透射電子顯微鏡內(nèi)觀察到了快速冷凍在無序冰中的病毒顆粒。Jacques Dubochet發(fā)明的方法因?yàn)榻禍匮杆伲ā?0000℃/s），可以將生物大分子在溶液中的結(jié)構(gòu)狀態(tài)迅速固定；液氮溫度下無序冰的蒸汽壓遠(yuǎn)低于透射電子顯微鏡內(nèi)部的真空氣壓；液氮溫度可以降低高能電子對生物大分子的輻照損傷，因此，Dubochet方法解決了透射電子顯微鏡觀察含水生物樣品的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸。在透射電子顯微鏡中保持冷凍樣品的低溫狀態(tài)也是若干科學(xué)家努力解決的技術(shù)難題，其中包括Richard Henderson在1990年代設(shè)計(jì)的采用Dewar罐保持樣品處于液氮溫度下的冷凍樣品桿，Yoshinory Fujiyoshi發(fā)明的直接對透射電鏡中樣品臺進(jìn)行低溫冷卻的技術(shù)。后者的技術(shù)甚至可以實(shí)現(xiàn)將樣品的溫度降低到液氦的溫度下（絕對溫度-269.15℃）進(jìn)行透射電子顯微學(xué)觀察，從而進(jìn)一步降低高能電子的輻照損傷。這種利用低溫制備樣品及進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察的技術(shù)在過去的30年里日臻成熟，成為現(xiàn)在普遍使用的冷凍電子顯微學(xué)技術(shù)（簡稱“冷凍電鏡”）。

2 生物大分子三維重構(gòu)技術(shù)的發(fā)展

透射電子顯微鏡的成像是電子束穿透樣品，將樣品的三維電勢密度分布函數(shù)沿著電子束的傳播方向投影至與傳播方向垂直的二維平面上。生物大分子的三維結(jié)構(gòu)信息則隱藏在分子沿不同角度的二維投影中。1968年，Aaron Klug（1982年度諾貝爾化學(xué)獎獲得者）發(fā)現(xiàn)了中心截面定理，提出了三維物體沿一個(gè)角度的二維投影的Fourier變換等同于三維物體Fourier變換的一個(gè)與投影角度垂直方向的中心截面。因此如果可以確定一個(gè)分子結(jié)構(gòu)多個(gè)不同角度二維投影之間的相對空間關(guān)系，即可以在Fourier空間中獲得多個(gè)中心截面的疊加；當(dāng)投影角度數(shù)目足夠多時(shí)，即可以填滿Fourier三維空間，從而實(shí)現(xiàn)分子結(jié)構(gòu)的三維重構(gòu)（reconstruction）。根據(jù)這一原理，利用透射電子顯微鏡采集生物樣品多個(gè)角度的放大電子顯微圖像，即可能在計(jì)算機(jī)里重構(gòu)出它的三維空間結(jié)構(gòu)。

根據(jù)中心截面定理，具有螺旋對稱的分子組裝體系其單張電子顯微鏡照片即包含了分子多個(gè)不同角度的二維投影，因此可以利用螺旋對稱性質(zhì)重構(gòu)出三維結(jié)構(gòu)。Aaron Klug最初就是對具有螺旋對稱性的噬菌體桿狀尾部電子顯微鏡照片進(jìn)行了三維重構(gòu)，在隨后的幾年里又對具有螺旋對稱性的TMV、微管等應(yīng)用電子顯微學(xué)進(jìn)行了三維重構(gòu)。Richard Henderson與Nigel Unwin利用高度有序的二維晶體，通過獲得二維晶體的不同傾轉(zhuǎn)角度的電子顯微照片與電子衍射圖，首次實(shí)現(xiàn)了二維晶體的三維重構(gòu)。隨后，Richard Henderson致力于改進(jìn)解析二維晶體的計(jì)算機(jī)軟件算法和提高二維晶體的冷凍電鏡圖像與衍射圖譜質(zhì)量，于1990年首次實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用冷凍電子顯微學(xué)解析蛋白質(zhì)分子的原子分辨率結(jié)構(gòu)，即細(xì)菌視紫紅質(zhì)的3.2 ?分辨率三維重構(gòu)。Nigel Unwin則致力于對乙酰膽堿受體所形成的螺旋排列管狀晶體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，并開發(fā)了一系列螺旋三維重構(gòu)的算法，并最終解析出了該蛋白的近原子分辨率三維結(jié)構(gòu)。具有正二十面體對稱性的病毒顆粒只需要較少的幾個(gè)方向的投影照片，也可以利用中心截面定理進(jìn)行三維重構(gòu)。

對于絕大多數(shù)生物大分子，尤其是生物大分子復(fù)合體，并不具備高對稱性，也不容易形成螺旋對稱性或二維晶體的有序排列。這些分子在溶液中處于分散分布的狀態(tài)，當(dāng)制備了電子顯微鏡樣品后，各個(gè)分子以隨機(jī)的取向分布在樣品中，稱為單顆粒。Joachim Frank從20世紀(jì)70年代起，開始致力于對這種狀態(tài)的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行電子顯微學(xué)解析，從而開發(fā)了單顆粒三維重構(gòu)算法。單顆粒重構(gòu)的一個(gè)重要假設(shè)是分散分布于溶液中的同一種生物大分子具有相似的結(jié)構(gòu)，因此它們的電子顯微鏡照片可以被認(rèn)為是同一種三維結(jié)構(gòu)的不同角度的投影。因?yàn)樯锎蠓肿釉跇悠分械陌窠橘|(zhì)形成的背景噪音，以及為了減少高能電子對樣品的輻照損傷所采用的很低電子劑量的成像條件導(dǎo)致信號很弱，生物大分子的電子顯微照片的信噪比很低，是不能用單顆粒的照片直接獲得可靠的三維重構(gòu)的。Joachim Frank開創(chuàng)性地將統(tǒng)計(jì)學(xué)方法引入到電子顯微鏡圖像分析中，通過對多個(gè)單顆粒的圖像進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過對正、加和平均等圖像操作手段從多個(gè)顆粒圖像中提取信號，提高信噪比。Joachim Frank以及Marin van Heel各自領(lǐng)導(dǎo)的研究組又發(fā)展了一系列方法，可以確認(rèn)高信噪比的二維圖像之間的空間投影關(guān)系從而獲得正確的三維重構(gòu)。這些方法包括等價(jià)線方法、隨機(jī)圓錐重構(gòu)法、隨機(jī)初始模型迭代收斂重構(gòu)等方法。Joachim Frank組開發(fā)的軟件SPIDER以及Marin van Heel組開發(fā)的軟件IMAGIC成為最早進(jìn)行單顆粒三維重構(gòu)的軟件包。從1986年Joachim Frank組獲得第一個(gè)50 ?分辨率的核糖體的三維重構(gòu)到2000年獲得10 ?分辨率的核糖體三維重構(gòu)，單顆粒重構(gòu)技術(shù)逐漸被冷凍電鏡領(lǐng)域所接受。Steven Ludtke開發(fā)了較為方便的圖形操作界面EMAN，進(jìn)一步推動了單顆粒技術(shù)的應(yīng)用。利用冷凍樣品，Tony Crowther 與Alasdair Stevens等采用類似的單顆粒重構(gòu)原理開始對正二十面體病毒顆粒的冷凍電鏡照片進(jìn)行三維重構(gòu)分析，在1996年同時(shí)獨(dú)立解析了乙肝病毒衣殼的亞納米分辨率結(jié)構(gòu)。Nikolaus Grigorieff，Z.Hong Zhou和Wah Chiu領(lǐng)導(dǎo)的研究組分別在2008年解析了正二十面體病毒的原子分辨率結(jié)構(gòu)，首次證明了單顆粒技術(shù)可以作為完全獨(dú)立的結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段解析生物大分子復(fù)合體的原子模型。

3 冷凍電鏡硬件技術(shù)的革命性突破

冷凍電子顯微鏡的技術(shù)進(jìn)步離不開顯微鏡本身硬件的發(fā)展。在過去的幾十年中，主要的透射電子顯微鏡廠家（FEI、JEOL、Zeiss等）一直在努力提高冷凍電子顯微鏡的機(jī)械及光學(xué)穩(wěn)定性、自動化程度以及冷凍樣品的特殊需求性能等指標(biāo)。不斷改進(jìn)的透射電子顯微鏡儀器為冷凍電子顯微學(xué)技術(shù)的發(fā)展提供了堅(jiān)實(shí)的保障，也為革命性技術(shù)的誕生奠定了良好的基礎(chǔ)。冷凍電子顯微鏡的高分辨率圖像采集設(shè)備的技術(shù)革新是冷凍電鏡過去10年來最重要硬件技術(shù)突破之一，直接導(dǎo)致了冷凍電鏡技術(shù)在分辨率水平上的迅速躍遷。

傳統(tǒng)的電子顯微學(xué)圖像采集介質(zhì)一直使用基于化學(xué)感光的黑白底片，然后經(jīng)過復(fù)雜的顯影、定影等過程后使用專門的掃描儀將電子顯微照片數(shù)字化之后在計(jì)算機(jī)里進(jìn)行圖像處理。從20個(gè)世紀(jì)末開始，CCD相機(jī)（電荷耦合元件，將高能量的電子信號通過熒光板先轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?，再將光信號通過光纖傳導(dǎo)至半導(dǎo)體芯片上轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字信號）開始被應(yīng)用于電子顯微鏡的圖像采集系統(tǒng)。相比于底片，CCD相機(jī)的一個(gè)優(yōu)勢是可以實(shí)時(shí)獲得數(shù)字化的電子顯微圖像，從而使得對圖像質(zhì)量的評估以及樣品采樣的效率大大提升，并促成了初步的冷凍電子顯微學(xué)自動化軟件的誕生（Leginon，SerialEM，AutoEMation等）。但是CCD的缺陷是其高分辨率信息丟失嚴(yán)重，導(dǎo)致DQE（detective quantum efficiency，探測量子效率）在圖像高頻區(qū)域的顯著下降，比底片記錄的數(shù)據(jù)的質(zhì)量差很多。

2005年，A. R. Faruqi和Richard Henderson提出可以使用基于CMOS（互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體）技術(shù)開發(fā)的直接電子探測裝置來提高電子顯微鏡圖像采集設(shè)備的DQE。2005同年，第一個(gè)對電子直接進(jìn)行探測成像的采集設(shè)備Direct Detection Device在美國San Diego實(shí)驗(yàn)室誕生，可以進(jìn)行高速成像，從而實(shí)現(xiàn)對樣品的不間斷連續(xù)采樣。2011年和2012年，Nikolaus Grigorieff和Bridget Carragher首次應(yīng)用Direct Electron公司生產(chǎn)的DDD相機(jī)拍攝了處于液氮溫度下病毒冷凍樣品的電子顯微電影，并發(fā)現(xiàn)在液氮溫度下冷凍樣品的漂移現(xiàn)象可以通過對電影中不同幀之間的變化情況分析及后處理來進(jìn)行校正，從而極大地提高獲取高質(zhì)量圖像的成功率。2013年，兩篇工作獨(dú)立地報(bào)道了應(yīng)用直接電子探測裝置獲得大分子復(fù)合體原子分辨率的三維重構(gòu)。在一個(gè)工作中，英國MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Sjors Scheres和Richard Henderson研究組與FEI公司合作開發(fā)了Falcon相機(jī)，通過拍攝連續(xù)電影及后續(xù)的圖像處理，解析了核糖體的原子分辨率結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)工作中，UCSF的David Agard和Yifan Cheng研究組與Lawrence Berkeley National Laboratory的Peter Denes研究組協(xié)同美國的Gatan公司開發(fā)了K2相機(jī)，實(shí)現(xiàn)了單電子計(jì)數(shù)成像技術(shù)，并通過拍攝連續(xù)電影及后續(xù)的圖像處理，解析了20S蛋白酶體復(fù)合體的原子分辨率結(jié)構(gòu)。2013年12月《Nature》上發(fā)表了Yifan Cheng研究組與David Julies研究組應(yīng)用最新型的K2相機(jī)對結(jié)構(gòu)完全未知的膜蛋白TRPV1利用冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)技術(shù)解析出來的原子模型，標(biāo)志著冷凍電鏡技術(shù)全面進(jìn)入原子分辨率時(shí)代。這些最新的研究成果同時(shí)應(yīng)用了Sjors Scheres開發(fā)的基于概率論的單顆粒三維重構(gòu)分析算法及其程序Relion。這種基于概率論的單顆粒三維重構(gòu)算法原理最早由耶魯大學(xué)的Frederick Sigworth教授于1998年提出，由Sjors Scheres完善并開發(fā)成為實(shí)用的圖像處理軟件，今天已經(jīng)成為冷凍電鏡單顆粒結(jié)構(gòu)解析的主流軟件包。

如今，冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)技術(shù)已經(jīng)成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的主流方法，眾多過去應(yīng)用其它結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段無法解析的重要生物大分子復(fù)合體的結(jié)構(gòu)被解析出來，如剪接體、光系統(tǒng)-捕光復(fù)合物超復(fù)合體、呼吸鏈超復(fù)合體和藻膽體。有越來越多的研究組利用冷凍電鏡技術(shù)去嘗試無對稱性，低分子量和柔型較大的生物大分子或復(fù)合體。目前能夠利用冷凍電鏡技術(shù)解析的最高分辨率是1.8 ?（GDH），而能夠成功解析到近原子分辨率的最小生物分子是64 kD的血紅蛋白。

4 中國冷凍電鏡的發(fā)展及現(xiàn)狀

中國科學(xué)家從20世紀(jì)90年代開始從事冷凍電鏡的研究工作。其中，清華大學(xué)隋森芳領(lǐng)導(dǎo)的課題組在磷脂單層膜上生長蛋白質(zhì)的二維晶體，并利用透射電鏡來研究這些蛋白的結(jié)構(gòu)以及它們與膜的相互作用。中國科學(xué)院生物物理研究所的徐偉開始研究膜蛋白的二維晶體。中山大學(xué)的張景強(qiáng)與湘潭大學(xué)的楊奇斌利用冷凍電鏡技術(shù)解析病毒的結(jié)構(gòu)。材料科學(xué)領(lǐng)域的郭可信與李方華也開始開展冷凍電鏡的研究工作。這些研究組嘗試著自己開發(fā)搭建相應(yīng)的硬件和軟件工具來進(jìn)行開創(chuàng)性的研究，并發(fā)表了若干篇全部在國內(nèi)完成的冷凍電鏡研究論文，同時(shí)也培養(yǎng)出了中國第一批從事冷凍電鏡研究的青年學(xué)生。

自2000年以來，隨著國家開始投入更多的資源升級電鏡設(shè)施，并加大科研經(jīng)費(fèi)的支持力度，一些經(jīng)過良好訓(xùn)練的年輕科學(xué)家回到中國，建立了一批冷凍電鏡實(shí)驗(yàn)室，開始了他們的獨(dú)立研究工作。這些實(shí)驗(yàn)室分布在清華大學(xué)、北京大學(xué)、中山大學(xué)、中國科技大學(xué)、浙江大學(xué)、上?？萍即髮W(xué)、南開大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、廈門大學(xué)、中國科學(xué)院生物物理研究所、北京生命科學(xué)研究所、上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所、上海藥物所等學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)。中國冷凍電鏡研究的群體逐漸成長、成熟，高速的發(fā)展吸引了全世界科研界的關(guān)注。如今，中國從事冷凍電鏡開發(fā)與應(yīng)用研究的課題組已經(jīng)超過40個(gè)，形成了近500人的中國冷凍電子顯微學(xué)分會，在國內(nèi)正在建設(shè)10多個(gè)大型冷凍電鏡平臺設(shè)施，并在過去的幾年中發(fā)表了幾十篇國際一流水平的科研成果，為世界矚目。

5 冷凍電鏡的技術(shù)難點(diǎn)與未來發(fā)展趨勢

1）樣品制備技術(shù)。樣品制備已經(jīng)成為冷凍電子顯微學(xué)結(jié)構(gòu)解析的限速步驟。冷凍電子顯微學(xué)要成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的主要應(yīng)用手段，必須在樣品制備這一步驟取得重要的突破。類似地，對于細(xì)胞結(jié)構(gòu)研究來說，將本身很厚的細(xì)胞樣品進(jìn)行減薄處理，才適合冷凍電鏡觀察。在過去的10多年里，冷凍切片技術(shù)一直在穩(wěn)步發(fā)展，至今已經(jīng)成為相對成熟的技術(shù)，但是對該技術(shù)的熟練掌握仍然需要長期的培訓(xùn)與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。最近發(fā)展起來的聚焦離子束減薄技術(shù)在未來可能會對冷凍細(xì)胞樣品的結(jié)構(gòu)研究帶來新的契機(jī)。

2）高分辨率結(jié)構(gòu)的分析與建模。應(yīng)用冷凍電子顯微學(xué)技術(shù)在過去的兩年里所獲得的近原子分辨率（4 ?以上）三維結(jié)構(gòu)的數(shù)目幾乎超過了前面幾十年所獲得的高分辨率結(jié)構(gòu)數(shù)目之和。更多的在4～8 ?分辨率范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)在很短時(shí)間內(nèi)被解析出來。不同的分辨率結(jié)構(gòu)可以揭示出的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)亦不同。而與晶體學(xué)手段不同，冷凍電子顯微學(xué)單顆粒重構(gòu)無法通過對晶格衍射點(diǎn)的信號強(qiáng)弱來判斷分辨率。如何客觀地對三維重構(gòu)的結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)、對結(jié)構(gòu)解析分辨率進(jìn)行明確的確定是目前高分辨率冷凍電鏡研究中的重要問題。在此基礎(chǔ)上，需要對不同分辨率水平的三維重構(gòu)進(jìn)行原子模型的構(gòu)建，從而實(shí)現(xiàn)在原子水平上對分子功能的解釋。對于分辨率在4 ?以內(nèi)的三維重構(gòu)基本可以應(yīng)用X射線晶體學(xué)現(xiàn)有的方法進(jìn)行建模。對分辨率在4 ?以外的三維結(jié)構(gòu)如何建立較為可信的模型，則仍缺少相對成熟并被普遍接受的方法。一些研究組正在利用同源建模、分子動力學(xué)模擬等手段來進(jìn)行這一分辨率水平的原子模型搭建的嘗試。

3）構(gòu)象不均一性的分析。冷凍電子顯微學(xué)單顆粒結(jié)構(gòu)解析技術(shù)與晶體學(xué)技術(shù)的一個(gè)重要差異是不需要溶液中的生物大分子形成高度有序的晶體排列，因而可以直接獲得溶液中的生物大分子結(jié)構(gòu)。但生物大分子尤其是大分子復(fù)合體本身的構(gòu)象柔性因此沒有被固定在晶體結(jié)構(gòu)中。這些構(gòu)象柔性反映在電子顯微圖像中，常常是導(dǎo)致三維重構(gòu)無法獲得高分辨率結(jié)構(gòu)的根源。將不同構(gòu)象的分子分開分析，是提高重構(gòu)分辨率的重要過程。此外，分子在溶液中的不同構(gòu)象很可能反映了分子發(fā)揮功能的不同結(jié)構(gòu)形態(tài)，理解這些構(gòu)象差異對于解釋分子功能的機(jī)制非常重要。目前對生物大分子構(gòu)象不均一性的分析是冷凍電子顯微學(xué)結(jié)構(gòu)解析中的技術(shù)難點(diǎn)和熱點(diǎn)。對這個(gè)問題的解決需要更多的新思路和新算法。

4）電子光學(xué)新技術(shù)方法在生物樣品研究中的應(yīng)用。材料科學(xué)超高分辨率研究在過去十幾年里也出現(xiàn)了很多重要的技術(shù)進(jìn)步，主要是電子顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的不斷完善和提高，以及新的成像手段的進(jìn)步。新的技術(shù)諸如球差矯正、色差矯正、掃描透射電子顯微鏡系統(tǒng)等都在材料科學(xué)領(lǐng)域結(jié)構(gòu)分辨率的顯著提高中發(fā)揮了重要作用。目前，利用最新的電子光學(xué)成像系統(tǒng)，物理學(xué)和材料科學(xué)研究者已經(jīng)可以獲得0.5 ?的分辨率。隨著對生物樣品近原子分辨率結(jié)構(gòu)解析能力的逐漸普及，更高的分辨率必然成為冷凍電子顯微學(xué)發(fā)展的下一個(gè)目標(biāo)。如何應(yīng)用材料科學(xué)領(lǐng)域證明對超高分辨成像卓有成效的電子顯微學(xué)方法來提高生物樣品的結(jié)構(gòu)解析分辨率，使所有冷凍電子顯微學(xué)家面臨著新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。此外，新的技術(shù)如電子顯微鏡相位板（phase-plate）的開發(fā)與應(yīng)用已經(jīng)被證明對于利用單顆粒技術(shù)解析小分子量的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及利用電子斷層掃描三維重構(gòu)技術(shù)研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有重大的促進(jìn)作用。該項(xiàng)技術(shù)很可能在未來幾年里引起冷凍電子顯微學(xué)的另一次新的重大突破。

5）體內(nèi)結(jié)構(gòu)的研究。自從20世紀(jì)中期建立以來，結(jié)構(gòu)生物學(xué)主要是通過對分離純化至體外的生物大分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。至今解析出來的多達(dá)10萬的生物大分子結(jié)構(gòu)對于理解生物學(xué)過程的分子機(jī)制發(fā)揮了重要的作用。但迄今為止，科學(xué)家仍很難通過直接觀察獲得細(xì)胞內(nèi)乃至體內(nèi)的生物大分子的原子分辨率結(jié)構(gòu)。冷凍電子顯微學(xué)尤其是三維斷層掃描重構(gòu)的發(fā)展給我們提供了這樣的契機(jī)。通過更穩(wěn)定的電子顯微鏡系統(tǒng)、更高效的數(shù)據(jù)采集裝置、更強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)處理工具，三維斷層掃描重構(gòu)已經(jīng)可以幫助我們對細(xì)胞內(nèi)的特定分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行重構(gòu)和統(tǒng)計(jì)分析，從而獲得它們的高分辨率結(jié)構(gòu)。如何對細(xì)胞中特定分子的標(biāo)定則是目前冷凍電子顯微學(xué)細(xì)胞結(jié)構(gòu)研究面臨的一個(gè)主要技術(shù)問題。如果能實(shí)現(xiàn)以上目標(biāo)，冷凍電子顯微學(xué)將可能真正填補(bǔ)結(jié)構(gòu)生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)之間的空隙，使得我們從不同空間與時(shí)間尺度上對生物體的理解更加完整。冷凍電鏡未來將可能帶給我們更多的驚喜?！?/p>