生物工程

常壓室溫等離子體快速誘變產(chǎn)油酵母的條件及其突變株的特性

金麗華，方明月，張翀，等

摘要：目的：利用微生物轉(zhuǎn)化生物質(zhì)生產(chǎn)生物柴油是發(fā)展可再生清潔能源的重要途徑之一。但微生物合成油脂存在培養(yǎng)過(guò)程復(fù)雜、產(chǎn)油效率有限、菌種耐受性差等問(wèn)題，限制微生物生產(chǎn)油脂技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。本論文采用了課題組自主發(fā)明的常壓室溫等離子體（ARTP）方法構(gòu)建產(chǎn)油圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）突變庫(kù)，設(shè)計(jì)高通量篩選方法篩選高產(chǎn)油脂的突變株，并表征其發(fā)酵性能。方法：（1）誘變：采用了常壓室溫等離子體（ARTP）照射2分鐘菌液的方法誘變產(chǎn)油圓紅冬孢酵母，將照射處理后的產(chǎn)油酵母稀釋，并涂板培養(yǎng)出突變株的單菌落。（2）高通量篩選：為了快速篩選增殖速度快且產(chǎn)油量多的突變體，采用了基于尼羅紅染色的多孔板的高通量篩選方法。48孔板適合培養(yǎng)1 mL菌液，而且在培養(yǎng)過(guò)程中可以連續(xù)直接檢測(cè)細(xì)胞吸光度，或者是結(jié)合96孔板檢測(cè)其吸光度和相對(duì)油脂量。這一操作流程簡(jiǎn)便可行，實(shí)現(xiàn)了突變株的快速篩選。結(jié)果：（1）ARTP照射對(duì)圓紅冬孢酵母的致死效果比較明顯，ARTP處理10 s、1 min和4 min后細(xì)胞致死率分別達(dá)到80%、90%和100%。本實(shí)驗(yàn)為了便于選擇單菌落突變株，選取ARTP處理2 min（致死率為99%）進(jìn)行誘變處理。（2）ARTP誘變后獲得菌落培養(yǎng)48 h后，有12株誘變菌的增殖速度提高到原始菌的1.2倍以上（最高達(dá)到2.3倍）；以相對(duì)增殖速度為指標(biāo)計(jì)算出的產(chǎn)油酵母的總突變率為47.2%，其中正突變率達(dá)到27.2%。通過(guò)多孔板的高通量篩選方法獲得了 6株增殖速度和油脂產(chǎn)量都比原始菌株提高了20%以上的突變株（C4，D4，F(xiàn)4，A7，A8和E8）。（3）對(duì)篩選出的上述六株突變株進(jìn)行了六代的傳代培養(yǎng)后，對(duì)其油脂含量分析結(jié)果表明，ARTP誘變育種得到的突變體都具有良好的遺傳穩(wěn)定性。（4）上述 6株突變株的增殖速度及油脂量均是原始菌株的1.2倍以上。為了表征突變株的培養(yǎng)特性和油脂發(fā)酵過(guò)程，本文進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。結(jié)果表明，在未優(yōu)化的含20 g/L葡萄糖YEPD培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵78 h后，原始菌的細(xì)胞干重為8.4 g/L，而增殖速度最快的突變株C4和E8的細(xì)胞干重達(dá)到了12.3 g/L；突變株C4的產(chǎn)油量達(dá)到了4.07 g/L，是原始菌株的2.2倍，表明突變株的產(chǎn)油效率得到了顯著提高。結(jié)論：本研究表明，ARTP誘變育種方法能夠快速有效地獲得高產(chǎn)油脂圓紅冬孢酵母突變株，且其遺傳穩(wěn)定性良好。以增殖速度為指標(biāo)的總突變率為47.2%，其中正突變率達(dá)到27.2%。以增殖速度和油脂產(chǎn)量為指標(biāo)，通過(guò)基于多孔板的高通量篩選方法，篩選得到一株高產(chǎn)油脂的突變株C4，其在YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)78 h，產(chǎn)油量為原始菌的2.2倍，細(xì)胞濃度達(dá)到了原始菌株的1.5倍。本研究為高產(chǎn)油脂微生物的育種提供了高效方法。

來(lái)源出版物：生物工程學(xué)報(bào), 2011, 27(3): 461-467

入選年份：2016

生物降解地膜應(yīng)用與地膜殘留污染防控

嚴(yán)昌榮，何文清，薛穎昊，等

摘要：目的：地膜是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要物質(zhì)資料之一，地膜覆蓋技術(shù)應(yīng)用帶動(dòng)了我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式的重大改變和生產(chǎn)力的顯著提高。2014年地膜用量到達(dá)了144萬(wàn)t，覆膜面積超過(guò)1800萬(wàn)hm2，使作物大面積增產(chǎn)20%～50%，對(duì)保障我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品安全做出了重大貢獻(xiàn)。與此同時(shí)，由于大范圍、長(zhǎng)時(shí)間的地膜應(yīng)用、超薄地膜的泛濫以及未能進(jìn)行有效的回收，導(dǎo)致我國(guó)農(nóng)田地膜殘留污染問(wèn)題日益嚴(yán)重，已成為一個(gè)重大環(huán)境問(wèn)題。因此，本文針對(duì)我國(guó)地膜殘留污染特征不清和生物降解地膜大規(guī)模應(yīng)用制約因素不明確的問(wèn)題開(kāi)展研究。方法：基于文獻(xiàn)調(diào)研方法和研究團(tuán)隊(duì)十多年有關(guān)地膜試驗(yàn)評(píng)價(jià)和殘膜污染防控的研究積累，探明我國(guó)地膜覆蓋現(xiàn)狀、殘膜污染特點(diǎn)、生物降解地膜應(yīng)用趨勢(shì)和生物降解地膜存在的問(wèn)題和挑戰(zhàn)，對(duì)我國(guó)生物降解地膜應(yīng)用和殘膜污染防控提出對(duì)策建議。結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)，地膜覆蓋技術(shù)由于具有增加地溫、保持土壤水分、抑制雜草、抑鹽保苗、增加作物灌層中下部光照均勻程度和增加散射光等主要功能特點(diǎn)，成為提高農(nóng)作物產(chǎn)量和改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵。過(guò)去30多年來(lái)，地膜覆蓋應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)主要表現(xiàn)為：（1）地膜用量持續(xù)增加，覆膜面積進(jìn)一步上升；（2）應(yīng)用區(qū)域不斷擴(kuò)大，地膜使用強(qiáng)度逐年提高；（3）覆膜作物種類增加，技術(shù)模式日臻完善。地膜覆蓋的規(guī)模應(yīng)用對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)生了巨大影響，使得我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式和區(qū)域種植結(jié)構(gòu)發(fā)生了革命性的變化，主要表現(xiàn)在：（1）改變作物播期，擴(kuò)大了作物種植區(qū)域；（2）改變區(qū)域種植結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了新型種植模式；（3）提高農(nóng)作物產(chǎn)量，保障了國(guó)家糧食安全。殘留地膜污染調(diào)查的結(jié)果表明，不同地區(qū)由于使用量、使用方式及覆膜年限的不同，土壤中殘膜量也存在顯著差異；綠洲農(nóng)業(yè)區(qū)、黃土旱源區(qū)、東北風(fēng)沙區(qū)、華北地區(qū)和西南山區(qū)等 5大區(qū)域長(zhǎng)期覆膜農(nóng)田土壤中地膜殘留量為71.9～231.0 kg/hm2。地膜殘留污染的危害表現(xiàn)在：（1）破壞土壤結(jié)構(gòu)，降低了耕地地力水平；（2）影響土壤中水肥運(yùn)移，降低了水肥有效性；（3）影響作物生長(zhǎng)發(fā)育，降低農(nóng)作物產(chǎn)量。近年來(lái)以淀粉基降解地膜、完全生物降解地膜和纖維素類生物降解地膜3類為代表的生物降解地膜研發(fā)取得長(zhǎng)足發(fā)展。全國(guó)生物降解地膜試驗(yàn)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，生物降解地膜目前存在的普遍性問(wèn)題是機(jī)械強(qiáng)度不夠，鋪膜時(shí)容易斷裂，機(jī)械化操作困難；降解的時(shí)間可控性差，破裂時(shí)間過(guò)早；增溫保墑性能弱于普通PE地膜，尤其是作物生育前期最明顯，對(duì)作物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成造成一定的影響。因此，生物降解地膜存在的問(wèn)題和挑戰(zhàn)是：（1）產(chǎn)品抗拉強(qiáng)度有待于進(jìn)一步提高；（2）降解可控性與農(nóng)作物需求存在差異；（3）增溫保墑性能需要進(jìn)一步加強(qiáng)；（4）降低產(chǎn)品成本，促進(jìn)大規(guī)模應(yīng)用。結(jié)論：生物降解地膜成為替代普通PE地膜，解決地膜殘留污染的一種有效措施和手段，目前生物降解地膜正在處于產(chǎn)品研發(fā)和評(píng)價(jià)試驗(yàn)的關(guān)鍵階段，部分生物降解地膜產(chǎn)品在馬鈴薯、花生、煙草生產(chǎn)上顯示出良好的效果，但總體上還面臨巨大挑戰(zhàn)，主要包括需要進(jìn)一步提高地膜產(chǎn)品質(zhì)量，提高地膜產(chǎn)品破裂和降解可控性，改善地膜的增溫保墑能力，實(shí)現(xiàn)滿足農(nóng)作物對(duì)地膜覆蓋功能的要求；此外，需要降低生物降解地膜綜合成本，促進(jìn)生物降解地膜規(guī)?；瘧?yīng)用，尤其是要研發(fā)針對(duì)特定區(qū)域和特定作物的專用生物降解地膜產(chǎn)品，以滿足和適應(yīng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)多樣性的要求。總體上，在技術(shù)進(jìn)步和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境變化的條件下，生物降解地膜應(yīng)用將具有良好的前景。

來(lái)源出版物：生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(6): 748-760

入選年份：2016

泛素、泛素鏈和蛋白質(zhì)泛素化研究進(jìn)展

蘭秋艷，高媛，李衍常，等

摘要：泛素化（ubiquitination）是一種廣泛存在于真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，參與并介導(dǎo)了蛋白質(zhì)特異性降解、細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)等多種生理過(guò)程，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要的作用。泛素是一種由76個(gè)氨基酸組成的小蛋白，在酵母、線蟲(chóng)、果蠅、人類等幾乎所有的真核生物中具有高度保守的蛋白序列和結(jié)構(gòu)，其功能重要性可見(jiàn)一斑。在 E1（泛素激活酶）、E2（泛素耦聯(lián)酶）和E3（泛素連接酶）的級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)下，泛素分子共價(jià)連接到底物蛋白的賴氨酸殘基上實(shí)現(xiàn)泛素化修飾。同時(shí)，泛素化作為一種可逆的翻譯后修飾，受到多種去泛素化酶（DUB）的可逆性剪切，從而維持泛素化信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)平衡。泛素的起始甲硫氨酸和 7個(gè)賴氨酸殘基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）可作為泛素繼續(xù)修飾的位點(diǎn)，進(jìn)而形成同質(zhì)、異質(zhì)或者分支泛素鏈。晶體結(jié)構(gòu)研究顯示，泛素分子采用一種由5個(gè)β折疊包裹一個(gè)α螺旋的SSHSSS結(jié)構(gòu)，分子表面存在幾個(gè)重要的疏水表面，介導(dǎo)了泛素與多個(gè)泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的識(shí)別與結(jié)合。同時(shí)，不同的泛素鏈亦可形成不同的空間構(gòu)象，在不同級(jí)聯(lián)反應(yīng)酶的作用下，修飾多種底物蛋白的不同賴氨酸位點(diǎn)，參與到各異但可能存在部分互補(bǔ)性的信號(hào)傳遞反應(yīng)中，從而構(gòu)成了生物體內(nèi)底物泛素化修飾的宏觀與微觀不均一性。這為機(jī)體復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)以及有序的時(shí)空規(guī)律的調(diào)控維持提供了簡(jiǎn)潔但多樣的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究顯示，泛素化修飾參與基因復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)外源刺激的應(yīng)激等幾乎所有的生命活動(dòng)過(guò)程，并在多種生理進(jìn)程的發(fā)生發(fā)展中起到了至關(guān)重要的作用。因此某些關(guān)鍵底物蛋白上任何泛素化修飾的異常都可能引發(fā)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的失衡，進(jìn)而誘發(fā)一系列應(yīng)答信號(hào)，最終造成嚴(yán)重的病理效應(yīng)。探索機(jī)體各生理過(guò)程中泛素化修飾的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于理清重大疾病信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，尋找關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)及其特異性藥物也具有重要的意義。然而，泛素化信號(hào)的低豐度、不穩(wěn)定性、瞬時(shí)效應(yīng)以及復(fù)雜性給泛素化信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的搭建帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，隨著生命科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，高覆蓋定量蛋白質(zhì)組學(xué)、多種親和富集策略以及生物信息學(xué)等多種研究策略的廣泛應(yīng)用給這一領(lǐng)域的發(fā)展帶來(lái)了契機(jī)。相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)，人們將有能力將這一領(lǐng)域的研究帶入全新的局面。

來(lái)源出版物：生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(1): 14-30

入選年份：2016

血液制品的現(xiàn)狀與展望

王卓，趙雄，呂茂民，等

摘要：目的：本文旨在對(duì)血漿蛋白制品和相應(yīng)的重組制品研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，并對(duì)其未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)予以展望，以期為我國(guó)相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供借鑒和參考。方法：依據(jù)血漿蛋白的生理生化學(xué)，對(duì)其特性進(jìn)行基礎(chǔ)性介紹；根據(jù)血漿蛋白的臨床應(yīng)用效能，對(duì)其進(jìn)行分門別類并對(duì)不同種類血漿蛋白的血源和重組血漿蛋白制品研發(fā)與應(yīng)用進(jìn)行綜述分析；結(jié)合國(guó)內(nèi)外血漿蛋白制品研發(fā)與應(yīng)用現(xiàn)狀，對(duì)其未來(lái)發(fā)展進(jìn)行展望。結(jié)果：（1）血漿白蛋白制品最早應(yīng)用于戰(zhàn)傷救治的血液制品，高純白蛋白提高了血清蛋白臨床使用的安全性，注射級(jí)重組白蛋白可作為天然白蛋白的替代品用于臨床，輔料級(jí)重組白蛋白可作為藥物保護(hù)劑，重組白蛋白融合藥物的研發(fā)和上市開(kāi)創(chuàng)了血液制品的新局面。（2）免疫球蛋白作為傳統(tǒng)的抗體治療制劑經(jīng)歷了從動(dòng)物源免疫球蛋白到人源免疫球蛋白，從肌肉注射免疫球蛋白到靜脈注射免疫球蛋白，從正常免疫球蛋白到特異性免疫球蛋白的發(fā)展歷程，其使用范圍和適應(yīng)癥不斷擴(kuò)大。肌肉注射用免疫球蛋白因其制備工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，使用方便，價(jià)格低廉且不良反應(yīng)可以接受而一直在臨床實(shí)踐中應(yīng)用；靜脈注射用免疫球蛋白隨著新的適應(yīng)癥不斷發(fā)現(xiàn)，其應(yīng)用范圍越來(lái)越廣；皮下注射用免疫球蛋白的出現(xiàn)使免疫球蛋白的使用更加方便，已經(jīng)成為靜脈注射用免疫球蛋白安全有效的替代品；針對(duì)特定病原體的特異性免疫球蛋白在臨床上更具有不可替代的作用。（3）凝血因子和重組凝血因子類制品主要用于相應(yīng)的先天性遺傳性缺陷患者，纖維蛋白原、因子Ⅶ、因子Ⅷ、von Willebrand因子復(fù)合物、因子Ⅸ和凝血酶原復(fù)合物、因子Ⅺ、因子ⅩⅢ等制品在臨床中的應(yīng)用取得了良好的治療效果。因子Ⅶa和活化凝血酶原復(fù)合物對(duì)于治療產(chǎn)生凝血因子抑制物的血友病病人具有十分明顯的效果。纖維蛋白原類制品和凝血酶在外科止血方面發(fā)揮著重要的作用。（4）隨著分離技術(shù)的進(jìn)步，血漿中的許多少量或微量蛋白成分被分離提純。多種微量血漿蛋白制品已經(jīng)上市，如蛋白 C、抗凝血酶、α1-抗胰蛋白酶和組織纖溶酶原激活劑等。部分微量血漿蛋白制品也在研發(fā)和臨床試驗(yàn)過(guò)程中，如C1-抑制劑、補(bǔ)體系統(tǒng)Ⅰ因子、α2-巨球蛋白、血清膽堿酯酶、銅藍(lán)蛋白以及纖維結(jié)合蛋白等。結(jié)論：盡管多種重組血漿蛋白制品已經(jīng)上市，血漿來(lái)源的制品仍將具有其不可替代的特殊地位，新型血液成分制品、血漿蛋白制品的制備與鑒定技術(shù)已經(jīng)成為藥物研制和開(kāi)發(fā)的重要組成部分。目前，我國(guó)血液制品的研發(fā)與國(guó)外存在著較大的差距，血漿綜合利用率低、上市品種少是我國(guó)血液制品行業(yè)的現(xiàn)實(shí)，我國(guó)血液制品企業(yè)面臨著機(jī)遇與挑戰(zhàn)。

來(lái)源出版物：生物工程學(xué)報(bào), 2011, 27(5): 730-746

入選年份：2016