生物工程

常壓室溫等離子體快速誘變產(chǎn)油酵母的條件及其突變株的特性

金麗華，方明月，張翀，等

摘要：目的：利用微生物轉(zhuǎn)化生物質(zhì)生產(chǎn)生物柴油是發(fā)展可再生清潔能源的重要途徑之一。但微生物合成油脂存在培養(yǎng)過程復(fù)雜、產(chǎn)油效率有限、菌種耐受性差等問題，限制微生物生產(chǎn)油脂技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。本論文采用了課題組自主發(fā)明的常壓室溫等離子體（ARTP）方法構(gòu)建產(chǎn)油圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）突變庫，設(shè)計高通量篩選方法篩選高產(chǎn)油脂的突變株，并表征其發(fā)酵性能。方法：（1）誘變：采用了常壓室溫等離子體（ARTP）照射2分鐘菌液的方法誘變產(chǎn)油圓紅冬孢酵母，將照射處理后的產(chǎn)油酵母稀釋，并涂板培養(yǎng)出突變株的單菌落。（2）高通量篩選：為了快速篩選增殖速度快且產(chǎn)油量多的突變體，采用了基于尼羅紅染色的多孔板的高通量篩選方法。48孔板適合培養(yǎng)1 mL菌液，而且在培養(yǎng)過程中可以連續(xù)直接檢測細胞吸光度，或者是結(jié)合96孔板檢測其吸光度和相對油脂量。這一操作流程簡便可行，實現(xiàn)了突變株的快速篩選。結(jié)果：（1）ARTP照射對圓紅冬孢酵母的致死效果比較明顯，ARTP處理10 s、1 min和4 min后細胞致死率分別達到80%、90%和100%。本實驗為了便于選擇單菌落突變株，選取ARTP處理2 min（致死率為99%）進行誘變處理。（2）ARTP誘變后獲得菌落培養(yǎng)48 h后，有12株誘變菌的增殖速度提高到原始菌的1.2倍以上（最高達到2.3倍）；以相對增殖速度為指標計算出的產(chǎn)油酵母的總突變率為47.2%，其中正突變率達到27.2%。通過多孔板的高通量篩選方法獲得了 6株增殖速度和油脂產(chǎn)量都比原始菌株提高了20%以上的突變株（C4，D4，F(xiàn)4，A7，A8和E8）。（3）對篩選出的上述六株突變株進行了六代的傳代培養(yǎng)后，對其油脂含量分析結(jié)果表明，ARTP誘變育種得到的突變體都具有良好的遺傳穩(wěn)定性。（4）上述 6株突變株的增殖速度及油脂量均是原始菌株的1.2倍以上。為了表征突變株的培養(yǎng)特性和油脂發(fā)酵過程，本文進行了搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。結(jié)果表明，在未優(yōu)化的含20 g/L葡萄糖YEPD培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵78 h后，原始菌的細胞干重為8.4 g/L，而增殖速度最快的突變株C4和E8的細胞干重達到了12.3 g/L；突變株C4的產(chǎn)油量達到了4.07 g/L，是原始菌株的2.2倍，表明突變株的產(chǎn)油效率得到了顯著提高。結(jié)論：本研究表明，ARTP誘變育種方法能夠快速有效地獲得高產(chǎn)油脂圓紅冬孢酵母突變株，且其遺傳穩(wěn)定性良好。以增殖速度為指標的總突變率為47.2%，其中正突變率達到27.2%。以增殖速度和油脂產(chǎn)量為指標，通過基于多孔板的高通量篩選方法，篩選得到一株高產(chǎn)油脂的突變株C4，其在YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)78 h，產(chǎn)油量為原始菌的2.2倍，細胞濃度達到了原始菌株的1.5倍。本研究為高產(chǎn)油脂微生物的育種提供了高效方法。

來源出版物：生物工程學(xué)報, 2011, 27(3): 461-467

入選年份：2016

生物降解地膜應(yīng)用與地膜殘留污染防控

嚴昌榮，何文清，薛穎昊，等

摘要：目的：地膜是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要物質(zhì)資料之一，地膜覆蓋技術(shù)應(yīng)用帶動了我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式的重大改變和生產(chǎn)力的顯著提高。2014年地膜用量到達了144萬t，覆膜面積超過1800萬hm2，使作物大面積增產(chǎn)20%～50%，對保障我國農(nóng)產(chǎn)品安全做出了重大貢獻。與此同時，由于大范圍、長時間的地膜應(yīng)用、超薄地膜的泛濫以及未能進行有效的回收，導(dǎo)致我國農(nóng)田地膜殘留污染問題日益嚴重，已成為一個重大環(huán)境問題。因此，本文針對我國地膜殘留污染特征不清和生物降解地膜大規(guī)模應(yīng)用制約因素不明確的問題開展研究。方法：基于文獻調(diào)研方法和研究團隊十多年有關(guān)地膜試驗評價和殘膜污染防控的研究積累，探明我國地膜覆蓋現(xiàn)狀、殘膜污染特點、生物降解地膜應(yīng)用趨勢和生物降解地膜存在的問題和挑戰(zhàn)，對我國生物降解地膜應(yīng)用和殘膜污染防控提出對策建議。結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)，地膜覆蓋技術(shù)由于具有增加地溫、保持土壤水分、抑制雜草、抑鹽保苗、增加作物灌層中下部光照均勻程度和增加散射光等主要功能特點，成為提高農(nóng)作物產(chǎn)量和改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵。過去30多年來，地膜覆蓋應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢主要表現(xiàn)為：（1）地膜用量持續(xù)增加，覆膜面積進一步上升；（2）應(yīng)用區(qū)域不斷擴大，地膜使用強度逐年提高；（3）覆膜作物種類增加，技術(shù)模式日臻完善。地膜覆蓋的規(guī)模應(yīng)用對我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)生了巨大影響，使得我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式和區(qū)域種植結(jié)構(gòu)發(fā)生了革命性的變化，主要表現(xiàn)在：（1）改變作物播期，擴大了作物種植區(qū)域；（2）改變區(qū)域種植結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了新型種植模式；（3）提高農(nóng)作物產(chǎn)量，保障了國家糧食安全。殘留地膜污染調(diào)查的結(jié)果表明，不同地區(qū)由于使用量、使用方式及覆膜年限的不同，土壤中殘膜量也存在顯著差異；綠洲農(nóng)業(yè)區(qū)、黃土旱源區(qū)、東北風(fēng)沙區(qū)、華北地區(qū)和西南山區(qū)等 5大區(qū)域長期覆膜農(nóng)田土壤中地膜殘留量為71.9～231.0 kg/hm2。地膜殘留污染的危害表現(xiàn)在：（1）破壞土壤結(jié)構(gòu)，降低了耕地地力水平；（2）影響土壤中水肥運移，降低了水肥有效性；（3）影響作物生長發(fā)育，降低農(nóng)作物產(chǎn)量。近年來以淀粉基降解地膜、完全生物降解地膜和纖維素類生物降解地膜3類為代表的生物降解地膜研發(fā)取得長足發(fā)展。全國生物降解地膜試驗評價發(fā)現(xiàn)，生物降解地膜目前存在的普遍性問題是機械強度不夠，鋪膜時容易斷裂，機械化操作困難；降解的時間可控性差，破裂時間過早；增溫保墑性能弱于普通PE地膜，尤其是作物生育前期最明顯，對作物的生長發(fā)育和產(chǎn)量形成造成一定的影響。因此，生物降解地膜存在的問題和挑戰(zhàn)是：（1）產(chǎn)品抗拉強度有待于進一步提高；（2）降解可控性與農(nóng)作物需求存在差異；（3）增溫保墑性能需要進一步加強；（4）降低產(chǎn)品成本，促進大規(guī)模應(yīng)用。結(jié)論：生物降解地膜成為替代普通PE地膜，解決地膜殘留污染的一種有效措施和手段，目前生物降解地膜正在處于產(chǎn)品研發(fā)和評價試驗的關(guān)鍵階段，部分生物降解地膜產(chǎn)品在馬鈴薯、花生、煙草生產(chǎn)上顯示出良好的效果，但總體上還面臨巨大挑戰(zhàn)，主要包括需要進一步提高地膜產(chǎn)品質(zhì)量，提高地膜產(chǎn)品破裂和降解可控性，改善地膜的增溫保墑能力，實現(xiàn)滿足農(nóng)作物對地膜覆蓋功能的要求；此外，需要降低生物降解地膜綜合成本，促進生物降解地膜規(guī)模化應(yīng)用，尤其是要研發(fā)針對特定區(qū)域和特定作物的專用生物降解地膜產(chǎn)品，以滿足和適應(yīng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)多樣性的要求?？傮w上，在技術(shù)進步和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境變化的條件下，生物降解地膜應(yīng)用將具有良好的前景。

來源出版物：生物工程學(xué)報, 2016, 32(6): 748-760

入選年份：2016

泛素、泛素鏈和蛋白質(zhì)泛素化研究進展

蘭秋艷，高媛，李衍常，等

摘要：泛素化（ubiquitination）是一種廣泛存在于真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，參與并介導(dǎo)了蛋白質(zhì)特異性降解、細胞周期調(diào)控、信號傳導(dǎo)等多種生理過程，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要的作用。泛素是一種由76個氨基酸組成的小蛋白，在酵母、線蟲、果蠅、人類等幾乎所有的真核生物中具有高度保守的蛋白序列和結(jié)構(gòu)，其功能重要性可見一斑。在 E1（泛素激活酶）、E2（泛素耦聯(lián)酶）和E3（泛素連接酶）的級聯(lián)酶促反應(yīng)下，泛素分子共價連接到底物蛋白的賴氨酸殘基上實現(xiàn)泛素化修飾。同時，泛素化作為一種可逆的翻譯后修飾，受到多種去泛素化酶（DUB）的可逆性剪切，從而維持泛素化信號網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)平衡。泛素的起始甲硫氨酸和 7個賴氨酸殘基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）可作為泛素繼續(xù)修飾的位點，進而形成同質(zhì)、異質(zhì)或者分支泛素鏈。晶體結(jié)構(gòu)研究顯示，泛素分子采用一種由5個β折疊包裹一個α螺旋的SSHSSS結(jié)構(gòu)，分子表面存在幾個重要的疏水表面，介導(dǎo)了泛素與多個泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的識別與結(jié)合。同時，不同的泛素鏈亦可形成不同的空間構(gòu)象，在不同級聯(lián)反應(yīng)酶的作用下，修飾多種底物蛋白的不同賴氨酸位點，參與到各異但可能存在部分互補性的信號傳遞反應(yīng)中，從而構(gòu)成了生物體內(nèi)底物泛素化修飾的宏觀與微觀不均一性。這為機體復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)以及有序的時空規(guī)律的調(diào)控維持提供了簡潔但多樣的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究顯示，泛素化修飾參與基因復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期、生長發(fā)育以及對外源刺激的應(yīng)激等幾乎所有的生命活動過程，并在多種生理進程的發(fā)生發(fā)展中起到了至關(guān)重要的作用。因此某些關(guān)鍵底物蛋白上任何泛素化修飾的異常都可能引發(fā)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的失衡，進而誘發(fā)一系列應(yīng)答信號，最終造成嚴重的病理效應(yīng)。探索機體各生理過程中泛素化修飾的調(diào)控機制，對于理清重大疾病信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，尋找關(guān)鍵調(diào)控靶點及其特異性藥物也具有重要的意義。然而，泛素化信號的低豐度、不穩(wěn)定性、瞬時效應(yīng)以及復(fù)雜性給泛素化信號網(wǎng)絡(luò)的搭建帶來了巨大的挑戰(zhàn)。近年來，隨著生命科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，高覆蓋定量蛋白質(zhì)組學(xué)、多種親和富集策略以及生物信息學(xué)等多種研究策略的廣泛應(yīng)用給這一領(lǐng)域的發(fā)展帶來了契機。相信在不遠的將來，人們將有能力將這一領(lǐng)域的研究帶入全新的局面。

來源出版物：生物工程學(xué)報, 2016, 32(1): 14-30

入選年份：2016

血液制品的現(xiàn)狀與展望

王卓，趙雄，呂茂民，等

摘要：目的：本文旨在對血漿蛋白制品和相應(yīng)的重組制品研究現(xiàn)狀進行綜述，并對其未來發(fā)展趨勢予以展望，以期為我國相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供借鑒和參考。方法：依據(jù)血漿蛋白的生理生化學(xué)，對其特性進行基礎(chǔ)性介紹；根據(jù)血漿蛋白的臨床應(yīng)用效能，對其進行分門別類并對不同種類血漿蛋白的血源和重組血漿蛋白制品研發(fā)與應(yīng)用進行綜述分析；結(jié)合國內(nèi)外血漿蛋白制品研發(fā)與應(yīng)用現(xiàn)狀，對其未來發(fā)展進行展望。結(jié)果：（1）血漿白蛋白制品最早應(yīng)用于戰(zhàn)傷救治的血液制品，高純白蛋白提高了血清蛋白臨床使用的安全性，注射級重組白蛋白可作為天然白蛋白的替代品用于臨床，輔料級重組白蛋白可作為藥物保護劑，重組白蛋白融合藥物的研發(fā)和上市開創(chuàng)了血液制品的新局面。（2）免疫球蛋白作為傳統(tǒng)的抗體治療制劑經(jīng)歷了從動物源免疫球蛋白到人源免疫球蛋白，從肌肉注射免疫球蛋白到靜脈注射免疫球蛋白，從正常免疫球蛋白到特異性免疫球蛋白的發(fā)展歷程，其使用范圍和適應(yīng)癥不斷擴大。肌肉注射用免疫球蛋白因其制備工藝相對簡單，使用方便，價格低廉且不良反應(yīng)可以接受而一直在臨床實踐中應(yīng)用；靜脈注射用免疫球蛋白隨著新的適應(yīng)癥不斷發(fā)現(xiàn)，其應(yīng)用范圍越來越廣；皮下注射用免疫球蛋白的出現(xiàn)使免疫球蛋白的使用更加方便，已經(jīng)成為靜脈注射用免疫球蛋白安全有效的替代品；針對特定病原體的特異性免疫球蛋白在臨床上更具有不可替代的作用。（3）凝血因子和重組凝血因子類制品主要用于相應(yīng)的先天性遺傳性缺陷患者，纖維蛋白原、因子Ⅶ、因子Ⅷ、von Willebrand因子復(fù)合物、因子Ⅸ和凝血酶原復(fù)合物、因子Ⅺ、因子ⅩⅢ等制品在臨床中的應(yīng)用取得了良好的治療效果。因子Ⅶa和活化凝血酶原復(fù)合物對于治療產(chǎn)生凝血因子抑制物的血友病病人具有十分明顯的效果。纖維蛋白原類制品和凝血酶在外科止血方面發(fā)揮著重要的作用。（4）隨著分離技術(shù)的進步，血漿中的許多少量或微量蛋白成分被分離提純。多種微量血漿蛋白制品已經(jīng)上市，如蛋白 C、抗凝血酶、α1-抗胰蛋白酶和組織纖溶酶原激活劑等。部分微量血漿蛋白制品也在研發(fā)和臨床試驗過程中，如C1-抑制劑、補體系統(tǒng)Ⅰ因子、α2-巨球蛋白、血清膽堿酯酶、銅藍蛋白以及纖維結(jié)合蛋白等。結(jié)論：盡管多種重組血漿蛋白制品已經(jīng)上市，血漿來源的制品仍將具有其不可替代的特殊地位，新型血液成分制品、血漿蛋白制品的制備與鑒定技術(shù)已經(jīng)成為藥物研制和開發(fā)的重要組成部分。目前，我國血液制品的研發(fā)與國外存在著較大的差距，血漿綜合利用率低、上市品種少是我國血液制品行業(yè)的現(xiàn)實，我國血液制品企業(yè)面臨著機遇與挑戰(zhàn)。

來源出版物：生物工程學(xué)報, 2011, 27(5): 730-746

入選年份：2016