超聲輔助雙水相提取艾納香總黃酮的工藝優(yōu)化及抗氧化活性的研究

吳德智　田昌義　鄭強(qiáng)

摘要：以艾納香為原料、艾納香總黃酮得率為指標(biāo)，采用超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系對(duì)艾納香總黃酮提取工藝進(jìn)行單因素及Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)優(yōu)化，并用羥自由基清除力、DPPH自由基清除力以及還原力與一般回流提取所得的總黃酮的抗氧化能力進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明，艾納香總黃酮超聲輔助雙水相提取的最佳工藝條件為超聲時(shí)間31 min、（NH4）2SO4用量0.4 g/mL、液料比為32 mL ∶1 g，此條件下提取的艾納香總黃酮得率為（13.31±021）%。對(duì)DPPH自由基、羥自由基有較強(qiáng)的清除能力以及較高的還原力，且超聲輔助雙水相提取的艾納香總黃酮抗氧化能力顯著高于一般回流提取。

關(guān)鍵詞：艾納香總黃酮；超聲提??；雙水相；Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)；抗氧化

中圖分類號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）15-0153-04

艾納香，別稱大風(fēng)葉、大風(fēng)艾等，為菊科艾納香屬植物艾納香[Blumea balsamifera （L.） DC]新鮮或干燥地上部分，在我國主要分布于廣西、貴州等長江以南地區(qū)。其性味辛溫，具有溫中活血、祛風(fēng)除濕、殺菌止癢、消炎鎮(zhèn)痛等功效?，F(xiàn)代臨床主要應(yīng)用于抗菌、殺蟲、保肝及降血壓、擴(kuò)張血管、抑制交感神經(jīng)等[1-2]。主要含有黃酮類、揮發(fā)油等成分，其中艾納香黃酮類成分有抗腫瘤活性、抗氧化活性、抗酪氨酸激酶活性，開發(fā)潛力大，市場(chǎng)前景廣闊[3]。近年來“綠色化學(xué)”“環(huán)境友好型”提取工藝備受青睞[4]。超聲輔助提取是利用超聲波技術(shù)強(qiáng)化提取分離過程，能有效地縮短提取時(shí)間，提高產(chǎn)品的得率，還可以減少化學(xué)與物理危害，提高產(chǎn)品質(zhì)量[5]。雙水相提取是基于乙醇、異丙醇等有機(jī)物與無機(jī)鹽形成的新型雙水相體系與傳統(tǒng)的雙水相體系，根據(jù)被分離物質(zhì)在不同相中分配系數(shù)的不同從而實(shí)現(xiàn)分離的方法[6-7]。目前醇-鹽雙水相體系已經(jīng)被廣泛用于提取分離天然小分子化合物，成本低，萃取相不含黏度大、難處理的聚合物，有利于醇類的回收和具有良好的分離性能[8-9]。因此本研究以艾納香總黃酮提取率為指標(biāo)，通過單因素及Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化超聲輔助雙水相提取工藝條件，并用羥自由基清除力、DPPH自由基清除力以及還原力對(duì)抗氧化能力進(jìn)行研究，以期為艾納香黃酮的藥用和食用研究提供一定的參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料艾納香葉采自貴州省羅甸艾納香種植基地。

1.1.2試劑無水乙醇、（NH4）2SO4、鐵氰化鉀、無水Na2CO3等試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥98%，西安匯林生物科技有限公司）。

1.1.3儀器數(shù)控超聲清洗器（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平（FA1004B，上海越平科學(xué)儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海上天精密儀器有限公司）；紫外-可見分光光度計(jì)（UV-2550型，梅特勒-托利多國際股份有限公司）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1雙水相體系的確定及超聲輔助雙水相提取艾納香總黃酮的工藝

準(zhǔn)確稱取一定量艾納香葉，經(jīng)40 ℃干燥后粉碎裝入三角燒瓶中。加入適量的乙醇-硫酸銨溶液，按試驗(yàn)要求在超聲輔助條件下提取艾納香總黃酮。浸提后以 3 000 r/min 冷凍高速離心20 min。取上清液于40 ℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，所得濃縮液真空冷凍干燥，得艾納香總黃酮提取物。據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，（NH4）2SO4用量在0.2～0.6 g /mL 能形成較穩(wěn)定的雙水相體系。因此本試驗(yàn)固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%進(jìn)行其他工藝參數(shù)的考察。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，40%乙醇配制得135.0 mg/L的蕓香苷儲(chǔ)備液。精確吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蕓香苷儲(chǔ)備液，依次加入40%乙醇4.0 mL、5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL、10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，靜置 5 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液3 mL，乙醇定容至 10 mL。充分搖勻，靜置15 min后，509 nm下測(cè)定吸光度。得吸光度Y與濃度X（mg/L）的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程Y=0.101 2X-0000 5，r2=0.999 2。

1.3.3單因素考察超聲提取工藝

本試驗(yàn)針對(duì)超聲時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、（NH4）2SO4用量（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/mL）液料比[20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1、40 ∶1（mL ∶g）]3個(gè)因素，保持其中2個(gè)變量固定不變，對(duì)另一個(gè)變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以艾納香總黃酮提取率為指標(biāo)[10-11]，以確定Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)所需的水平范圍。

1.3.4Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)選艾納香總黃酮提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取微波功率、提取時(shí)間、液料比3個(gè)對(duì)艾納香總黃酮提取率影響較大的因素，采用 Design-Expert 8.0.6 提供的Box-Behnken試驗(yàn)，以艾納香總黃酮提取率為指標(biāo)優(yōu)化提取工藝參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1、表2所示。

1.3.5DPPH 自由基清除能力測(cè)定

以無水乙醇為溶劑，將總黃酮配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的溶液備用。精確吸取上述不同濃度的溶液300 μL，與2 mL 0.004% DPPH溶液充分混合后室溫下靜置20 min，在517 nm處測(cè)其吸光度（D1）。以不加提取液的DPPH 為空白對(duì)照，測(cè)定溶液在517 nm處的吸光度（D0）。精確吸取上述不同質(zhì)量濃度總黃酮溶液300 μL，分別與2 mL無水乙醇混合均勻后，以無水乙醇為對(duì)照，測(cè)定各溶液在517 nm處的吸光度（D2）[12]。同法對(duì)回流提取得到的總黃酮的DPPH自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算公式為：endprint

[JZ]DPPH自由基清除率=（1-[SX（]D1-D2D0[SX）]）×100%。

1.3.6鐵氰化鉀還原法測(cè)定還原力

配制不同濃度的總黃酮樣品溶液，取1.5 mL樣品，加入 1.5 mL、pH值6.6的磷酸鹽緩沖液和1.5 mL六氰合鐵酸鉀溶液，混勻后于50 ℃恒溫20 min，快速冷卻后加入1 mL 10% 三氯乙酸溶液，于 3 000 r/min 下離心10 min，取上清液1 mL再加入1 mL蒸餾水和1 mL 0.1% 三氯化鐵溶液，充分混勻靜置后，于 700 nm 處測(cè)定吸光度，以吸光度表示還原能力[13]。同法對(duì)回流提取得到的總黃酮還原力進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7羥自由基清除率

配制不同濃度的總黃酮樣品溶液，取1.5 mL樣品，分別加入1.0 mL 2.5 mmol/L的水楊酸溶液、1.0 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液和2.0 mL蒸餾水，充分混勻，加入1.0 mL 5 mmol/L的H2O2，置于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，再置于510 nm處測(cè)定其吸光度，以蒸餾水作空白參比[14]。同法對(duì)回流提取得到的總黃酮羥自由基清除率進(jìn)行測(cè)定。

[JZ]羥自由基清除率=[JB（[][SX（]D0-（D2-D1）D0[SX）][JB）]]×100%。

式中：D0為空白對(duì)照吸光度；D2為加H2O2樣品溶液吸光度；D1為不加H2O2樣品溶液吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1單因素考察艾納香總黃酮超聲輔助提取工藝

2.1.1超聲時(shí)間對(duì)艾納香總黃酮提取率的影響

由圖1-a可知，隨著超聲時(shí)間的增加，艾納香總黃酮提取率呈現(xiàn)先上升后下降再保持穩(wěn)定狀態(tài)的趨勢(shì)。當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，艾納香總黃酮提取率為12.98%，繼續(xù)延長超聲時(shí)間，總黃酮提取率維持在12.40%左右波動(dòng)。這主要是由于超聲波破壞了某些黃酮類成分的結(jié)構(gòu)而有所損失，造成提取率下降。因此選定20～30 min為超聲時(shí)間所需的水平范圍。

2.1.2（NH4）2SO4用量對(duì)艾納香總黃酮提取率的影響

由圖1-b可知，隨著（NH4）2SO4用量的增加，艾納香總黃酮提取率先上升后穩(wěn)定在一定水平。當(dāng)（NH4）2SO4用量大于 0.4 g/mL 時(shí)，提取率穩(wěn)定在12.78%左右波動(dòng)，當(dāng)繼續(xù)增加（NH4）2SO4[CM（20*2/3]用量時(shí)總黃酮提取率并沒有顯著增加。這主要

是由于（NH4）2SO4用量增加會(huì)與乙醇爭奪體系中的水，使總黃酮在乙醇相的含量減少，導(dǎo)致提取率下降。因此選定 0.3～0.5 g/mL為響應(yīng)面設(shè)計(jì)（NH4）2SO4用量的水平范圍。

2.1.3液料比對(duì)艾納香總黃酮提取率的影響

由圖1-c可知，隨著液料比的增加，艾納香總黃酮提取率先上升后穩(wěn)定在一定水平，沒有顯著性增加。當(dāng)液料比超過35 mL ∶1 g時(shí)，總黃酮提取率穩(wěn)定在12.89%左右波動(dòng)。主要是因?yàn)樘崛∫旱脑黾涌墒拱{香葉與提取溶劑充分接觸，有利于總黃酮的浸出，當(dāng)液料比超過35 mL ∶1 g時(shí)，總黃酮的提取基本達(dá)到飽和狀態(tài)。因此選定（25～35） mL ∶1 g為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的水平。

2.2Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化艾納香總黃酮微波輔助提取工藝

采用Design-Expert 8.0.6 提供的Box-Behnken試驗(yàn)，對(duì)各因素進(jìn)行擬合，得到多元回歸方程為：

R提取率=2.841 0+0.349 4A+21.267 5B+0.030 2C-0122 5AB+2.750 0×10-3AC-0.090 0BC-6.260 0×10-3A2-18.350 0B2-9.400 0×10-4C2。

對(duì)艾納香總黃酮提取率的回歸模型進(jìn)行方差及顯著性分析，結(jié)果見表3。該模型方程有顯著性影響（P<0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.202 1>0.05），說明在本試驗(yàn)條件下，該回歸模型所考察的因素足以反映試驗(yàn)中各提取工藝參數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響。判定系數(shù)R2=0.986 8，R2adj=0.969 9，說明回歸模型與試驗(yàn)值擬合均較好，可用于艾納香總黃酮提取率的理論推測(cè)和分析，各因素影響大小依次為液料比>超聲時(shí)間>（NH4）2SO4用量。由F檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)中液料比對(duì)總黃酮的提取率具有極顯著影響（P<0.01），超聲時(shí)間對(duì)總黃酮的提取率具有顯著影響（P<0.05）；交互項(xiàng)中超聲時(shí)間與（NH4）2SO4用量、超聲時(shí)間與料液比之間的交互作用對(duì)總黃酮提取率具有極顯著影響（P<0.01）；在二次項(xiàng)中超聲時(shí)間、（NH4）2SO4用量對(duì)總黃酮提取率具有極顯著影響（P<001）；其他因素之間不顯著（P>0.05），這與圖2中3D效應(yīng)面圖反映出的各因素間的交互作用相吻合。

由Design-Expert 8.0.6軟件得出艾納香總黃酮提取的最佳工藝參數(shù)是超聲時(shí)間30.92 min、（NH4）2SO4用量 0.4 g/mL、液料比為32.25 mL ∶1 g，總黃酮提取率的預(yù)測(cè)值為13.29%。為便于生產(chǎn)試驗(yàn)需求，定為超聲時(shí)間31 min、

（NH4）2SO4用量0.4 g/mL、液料比為32 mL ∶1 g，進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)，得出的總黃酮提取率為（13.31±0.21）%。該值與預(yù)測(cè)值比較接近，因此選取此為超聲輔助雙水相體系提取艾納香總黃酮的工藝參數(shù)。

2.3不同提取工藝提取的艾納香總黃酮抗氧化活性

2.3.1DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

由圖3可知，回流提取與超聲輔助雙水相提取得到的艾納香總黃酮對(duì)DPPH自由基均有較強(qiáng)的清除能力。濃度與DPPH自由基清除率存在正相關(guān)關(guān)系，且超聲輔助雙水相提取的清除能力顯著高于一般回流提?。≒<0.05）。當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí)，超聲輔助雙水相提取法提取的艾納香總黃酮對(duì)DPPH自由基清除率為78.8%，而回流提取的為73.9%。endprint

2.3.2還原力測(cè)定結(jié)果

吸光度與樣品的還原力具有正相關(guān)關(guān)系，吸光度越大，樣品的還原力越強(qiáng)。由圖4可知，回流提取與超聲輔助雙水相得到的艾納香總黃酮均具有較強(qiáng)的還原能力，說明不同提取法也均具有較強(qiáng)的抗氧化能力。在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，艾納香總黃酮的還原力隨著濃度的升高而增強(qiáng)，且超聲輔助雙水相提取的艾納香總黃酮還原力顯著高于一般回流提?。≒<0.05）。當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí)，超聲輔助雙水相提取的吸光度D700 nm為1.35 。

2.3.3羥自由基清除率

由圖5可知，回流提取與超聲輔助雙水相提取得到的艾納香總黃酮對(duì)羥自由基均有較強(qiáng)的清除能力。隨著總黃酮濃度的增加清除率也隨之提高，且超聲輔助雙水相提取的清除能力顯著高于一般回流提?。≒<005）。當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí)，超聲輔助提取法的清除率為75.9%，而回流提取為69.1%。

3結(jié)論

超聲波提取時(shí)間短、溫度低、效率高，是高效、節(jié)能、環(huán)保式的提取方式[15-16]，結(jié)合乙醇-硫酸銨雙水相體系操作，具有條件溫和、處理量大、易于連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于中藥材提取、生物工程、藥物分析和金屬分離等方面。本研究以艾納香為主要原料采用Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)對(duì)其總黃酮超聲輔助雙水相提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并比較該法與傳統(tǒng)回流提取所得的總黃酮進(jìn)行抗氧化能力比較。結(jié)果表明，超聲輔助雙水相提取艾納香總黃酮的最佳工藝條件為超聲時(shí)間31 min、（NH4）2SO4的用量0.4 g/mL、液料比為 32 mL ∶1 g，此條件下提取的艾納香總黃酮得率為（13.31±0.21）%。且對(duì)DPPH自由基、羥自由有較強(qiáng)的清除能力以及較高的還原力，且超聲輔助雙水相提取的艾納香總黃酮抗氧化能力顯著高于一般回流提取。

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