馬鈴薯EcoRⅠ/MseⅠ內(nèi)切酶組合AFLP反應(yīng)體系的優(yōu)化與引物篩選

李建武　李灝德　文國宏

摘要：以2個馬鈴薯品種為材料，對AFLP反應(yīng)過程中的關(guān)鍵因素（DNA濃度、酶切體系、擴增體系等）進行了優(yōu)化，旨在建立適合馬鈴薯的EcoRⅠ/MseⅠ內(nèi)切酶組合的AFLP反應(yīng)體系和篩選擴增條帶豐富的引物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化的馬鈴薯AFLP反應(yīng)體系為37 ℃酶切4 h，37 ℃連接4 h，連接產(chǎn)物稀釋10倍用于預(yù)擴增，預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋30倍用于選擇性擴增。利用建立的優(yōu)化反應(yīng)體系，以10個甘肅省主栽馬鈴薯品種為材料，從256對引物組合中篩選出24對擴增條帶多、條帶清晰、多態(tài)性好的引物組合。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；AFLP；體系建立與優(yōu)化；引物篩選

中圖分類號： S532.01文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0025-05

馬鈴薯作為甘肅省的第三大糧食作物，在全省農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟中占有重要的地位。作為馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)，甘肅省馬鈴薯種植面積穩(wěn)居全國第二，2014年種植面積70.8萬hm2[1]，初步形成了高寒陰濕脫毒種薯繁育區(qū)、旱作雨養(yǎng)區(qū)中部高淀粉及菜用型、河西及沿黃灌區(qū)全粉及薯片（條）加工型、隴南天水早熟菜用型等四大優(yōu)勢生產(chǎn)區(qū)域。甘肅省開展馬鈴薯育種工作已有40多年，先后選育出隴薯系列、天薯系列、武薯系列、莊薯系列和甘農(nóng)薯等40多個品種（系）[2]。

擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragments length polymorphism，AFLP）技術(shù)是由荷蘭科學(xué)家Vos等于1995年在RELP和RAPD基礎(chǔ)上建立起來的一種選擇性擴增酶切片段的方法[3-4]。AFLP具有多態(tài)性高、DNA用量少、結(jié)果穩(wěn)定性好的優(yōu)點，在水稻、大豆、小麥、馬鈴薯、甘蔗、棉花等作物的種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位研究、親緣關(guān)系鑒定等研究中得到了廣泛的應(yīng)用[5-12]。

近年來，分子標記技術(shù)已經(jīng)開始廣泛應(yīng)用到我國馬鈴薯種質(zhì)資源的研究中，如應(yīng)用SRAP技術(shù)開展了馬鈴薯遺傳多態(tài)性研究[13-14]，利用SSR和AFLP技術(shù)開展馬鈴薯指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性、遺傳圖譜構(gòu)建與QTL定位研究[15-20]。AFLP作為目前多態(tài)性最為豐富的標記，針對甘肅省主栽馬鈴薯品種和種質(zhì)資源方面的研究還未見報道，本研究在前人所用方法的基礎(chǔ)上優(yōu)化了馬鈴薯AFLP反應(yīng)體系，旨在為馬鈴薯遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定等奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

以農(nóng)業(yè)部西北旱作馬鈴薯科學(xué)觀測實驗站提供的馬鈴薯品種遠雜18號和農(nóng)天1號為材料，用于建立內(nèi)切酶EcoRⅠ/MseⅠ組合AFLP反應(yīng)體系；以甘肅省主栽的新大坪、隴薯5號、隴薯7號、隴薯8號、隴薯10號、莊薯3號、青薯9號、大西洋、費烏瑞它、LK99等10個馬鈴薯品種為材料篩選多態(tài)性較好的引物組合。

1.2試劑

本研究采用的基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和MseⅠ及T4 DNA連接酶均購自NEB（北京）有限公司；2×Taq Master Mix購自凌科生物科技（上海）有限公司；AFLP引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3基因組DNA的提取及質(zhì)量檢測

采用試劑盒法提取馬鈴薯DNA，取1 μL DNA樣品混合上樣緩沖液后在0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，以 DL2000 bp DNA Marker做對照，電泳緩沖液為1×TBE Buffer，電泳結(jié)束20 min后，取出凝膠放入濃度1 μg/mL的EB的電泳緩沖液染色15 min，取出凝膠后放置在美國Bio-rad伯樂Gel DocTM XR+成像系統(tǒng)觀察拍照，確定提取的DNA質(zhì)量和完整性。

1.4AFLP體系的建立

1.4.1酶切體系

酶切連接分2步進行。以遠雜18號的基因組DNA為模板，使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和MseⅠ組合對以上DNA樣品進行雙酶切。酶切體系為20 μL，包括10×Buffer（含BSA、ATP）2.0 μL，EcoRⅠ（20 U/μL） 0.1～0.2 μL，MseⅠ（10 U/μL） 0.2～0.4 μL，基因組DNA（100 ng/μL）3～6 μL，ddH2O 11.63～14.70 μL（表2），混勻后37 ℃水浴2～6 h。酶切結(jié)束后在68 ℃失活20 min， 酶切產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。期間對酶切反應(yīng)體系中的限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、MseⅠ濃度、基因組DNA濃度、酶切時間進行梯度優(yōu)化。

1.4.2連接反應(yīng)

連接反應(yīng)液10 μL：5 μmol/L EcoRⅠ退火接頭0.5 μL，50 μmol/L MseⅠ退火接頭0.5 μL，T4 DNA連接酶（400 U/μL）0.5 μL，10×Buffer 1 μL，ddH2O 7.5 μL，室溫下混勻，加入到10 μL酶切產(chǎn)物中，連接體系共20 μL，設(shè)4個處理，分別為37 ℃ 4 h，37 ℃過夜，16 ℃ 4 h，16 ℃過夜。連接反應(yīng)結(jié)束后，65 ℃下反應(yīng)10 min使連接酶失活，連接產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3預(yù)擴增優(yōu)化將連接產(chǎn)物分別設(shè)置6個不同的稀釋倍數(shù)（1×，5×，10×，15×，20×，30×）梯度，作為預(yù)擴增的模板，進行預(yù)擴增反應(yīng)。預(yù)擴增反應(yīng)體系20 μL，組分為酶切連接產(chǎn)物1.0 μL，2×Taq Master Mix預(yù)混液 10 μL，預(yù)擴增引物E-A（50 μmol/L）1.0 μL，預(yù)擴增引物M-C（50 μmol/L）1.0 μL，ddH2O 7.0 μL?；靹螂x心后按以下程序擴增：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，22個循環(huán)；72 ℃ 10 min，10 ℃保存。預(yù)擴增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余在-20 ℃保存用于選擇性擴增。endprint

1.4.4選擇性擴增優(yōu)化

將預(yù)擴增產(chǎn)物設(shè)置6個不同的稀釋倍數(shù)（10×，20×，30×，40×，50×，60×）梯度，作為選擇性擴增模板，進行選擇性擴增反應(yīng)。選擇性擴增反應(yīng)體系 20 μL，組分為預(yù)擴增產(chǎn)物2.0 μL，2×Taq Master Mix預(yù)混液10 μL，選擇性擴增引物E-nnn（50 μmol/L）1.0 μL，預(yù)擴增引物M-nnn（50 μmol/L）1.0 μL，ddH2O 6.0 μL，混勻離心后按以下程序擴增：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s（每個循環(huán)減低0.7 ℃），72 ℃ 1 min，12個循環(huán)；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，23個循環(huán)；72 ℃ 5 min，10 ℃保存。選擇性擴增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5聚丙烯酰胺凝膠電泳

取10 μL選擇性擴增產(chǎn)物，加入5 μL Loading Buffer，95 ℃ 變性5 min并迅速在冰浴中冷卻后，在恒定功率 80 W、變性聚丙烯酰胺凝膠（60 mL凝膠母液，300 μL過硫酸銨，60 μL TEMED）中電泳90 min。

1.6銀染及引物篩選

銀染方法參照文獻[21]，具體步驟：將凝膠放置在 1 500 mL 的固定液中（含10%乙醇，0.5%乙酸）固定5 min，轉(zhuǎn)入含有 0.1% AgNO3與0.1% 甲醛的染色中染色6 min；蒸餾水漂洗2 s；立即放入含1% NaOH與0.2%甲醛的顯影液中輕輕搖晃顯影至條帶清晰。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA提取

AFLP標記對DNA的純度及完整性要求較高，為了確保參試材料的基因組DNA純度和完整性，本研究采取試劑盒法提取了12份馬鈴薯材料的基因組DNA。經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖1）表明，基因組DNA濃度較低，無拖尾現(xiàn)象，殘留雜質(zhì)少且完整性好，在純度上完全能夠滿足AFLP分析的要求。

2.2AFLP體系優(yōu)化

2.2.1酶切反應(yīng)

以品種遠雜18號的基因組DNA為材料，使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和MseⅠ在37 ℃進行雙酶切反應(yīng) 4 h，對限制性內(nèi)切酶量與DNA濃度進行梯度篩選。酶切產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖2）表明，不同限制性內(nèi)切酶濃度對基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后片段大小集中在100～1 000 bp之間，彌散帶分布均勻，表明酶切徹底，符合AFLP對酶切效果的要求，其中當EcoRⅠ、MseⅠ分別為0.125、0.25 μL時，DNA濃度400～600 ng可滿足酶切效果，確定EcoRⅠ（20 U/μL）0.125 μL、MseⅠ（10 U/μL）0.25 μL、DNA（100 ng/μL）5 μL為酶切體系的反應(yīng)濃度。

以遠雜18號基因組DNA為材料，將20 μL酶切體系[EcoRⅠ（20 U/μL）0.125 μL，MseⅠ（10 U/μL）0.25 μL，DNA（100 ng/μL）5 μL，10×Buffer 2 μL，ddH2O 12.63 μL]放置在37 ℃下，設(shè)置2、3、4、5、6 h等5個梯度下篩選酶切反應(yīng)時間，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖3）表明，酶切3～5 h，產(chǎn)物彌散帶分布均勻，且條帶亮度較高，表明酶切產(chǎn)物豐富，符合AFLP對酶切效果的要求，確定4 h為適宜的酶切時間。

2.2.2連接反應(yīng)

經(jīng)EcoRⅠ 2.5 U和MseⅠ2.5 U對500 ng DNA在37 ℃下酶切4 h的產(chǎn)物為模板，在10 μL酶切體系中加入10 μL連接反應(yīng)液，連接體系共20 μL，經(jīng)不同溫度和時間連接反應(yīng)后，65 ℃下10 min使連接酶失活，連接產(chǎn)物在 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，4個處理的連接產(chǎn)物均為彌散狀，片段主要集中在100～1 000 bp，符合AFLP反應(yīng)要求，37 ℃連接4 h和過夜后片段濃度較低，亮度低，16 ℃連接4 h和過夜后，片段亮度高，連接效果較好，從縮短試驗周期、節(jié)約時間角度考慮，確定酶切連接溫度為37 ℃，時間為4 h（圖4）。

2.2.3預(yù)擴增優(yōu)化

預(yù)擴增以遠雜18號基因組DNA的酶切連接產(chǎn)物為模板，連接產(chǎn)物稀釋倍數(shù)分別為1、5、10、15、20、30倍，同時以農(nóng)天1號基因組DNA的酶切連接產(chǎn)物為重復(fù)。預(yù)擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖5、圖6）表明，不同稀釋倍數(shù)的模板即模板濃度對預(yù)擴增效果并無明顯影響，不稀釋時條帶集中在500 bp附近，稀釋20倍和30倍的模板擴增的條帶不清晰，稀釋10倍和15倍時條帶清晰，因此選擇稀釋10倍為最佳稀釋倍數(shù)。

2.2.3選擇性擴增優(yōu)化

選擇性擴增以遠雜18號基因組DNA預(yù)擴增產(chǎn)物為模板，預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)分別為10、20、30、40、50、60倍，同時以農(nóng)天1號基因組DNA的預(yù)擴增產(chǎn)物為重復(fù)。預(yù)擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖7、圖8）表明，不同稀釋倍數(shù)的模板即模板濃度對預(yù)擴增效果并無明顯影響，選擇性擴增片段介于100～500 bp之間，均符合AFLP分析要求，稀釋10倍、20倍和40倍時的模板選擇性擴增的條帶不清晰，預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋30倍、50倍和60倍時條帶清晰，因此選擇稀釋30倍為最佳稀釋倍數(shù)。

2.3最佳AFLP體系的確定與引物篩選

為了驗證所建立的馬鈴薯AFLP反應(yīng)體系是否穩(wěn)定，能否在各引物組合間普遍使用，試驗以品種隴薯7號材料所建立的體系，對12個甘肅省主栽馬鈴薯品種對限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和MseⅠ的引物256對組合進行了初步篩選。結(jié)果得到多態(tài)性均在5個以上的引物組合70對，多態(tài)性位點在8個以上的引物組合24對，分別為E-ACT/M-CGC、E-ACA/M-CCT、E-ACA/M-CCC、E-ACA/M-CCA、[JP2]E-ACA/M-CAT、E-ACA/M-CAG、E-ACA/M-CAC，E-AAC/M-CCG、E-AAC/M-CGC、E-ATG/M-CGT、E-ATG/M-CGC、E-ATA/M-CGT、E-ATA/M-CGG、E-AGG/M-CGA、E-AGG/M-CCG、E-AGG/M-CCA、E-AGG/M-CAT、E-AGC/M-CAT、E-AGC/M-CAA、E-ATT/M-CCG、E-AAG/M-CGG、E-ACG/M-CCC、E-ACA/M-CCG、E-ATT/M-CGA（圖9）。endprint

3討論

AFLP標記技術(shù)操作流程復(fù)雜，涉及到的步驟多、影響因素繁多，在實際的應(yīng)用過程中容易出現(xiàn)問題，導(dǎo)致整個試驗的失敗。因此，在DNA提取、酶切、連接、預(yù)擴增、選擇性擴增、凝膠電泳和銀染分析的每個環(huán)節(jié)都必須滿足技術(shù)要求，才能得到最佳結(jié)果。

高質(zhì)量的DNA是AFLP標記分析成功的關(guān)鍵。完整的基因組DNA能保證在后續(xù)的試驗中獲得整個基因組的多態(tài)性信息；高純度的DNA能保證限制性內(nèi)切酶酶切充分完全。本研究采用試劑盒法提取的馬鈴薯基因組DNA純度較高、完整性較好，符合AFLP標記酶切反應(yīng)對DNA質(zhì)量的要求。

酶切過程是AFLP標記分析成功關(guān)鍵環(huán)節(jié)。酶切時間受到植物樣本的基因組大小、序列以及所含的次生代謝產(chǎn)物影響[22]。本研究在37 ℃下設(shè)置了5個時間處理，酶切時間過短時，基因組DNA酶切不完全，沒有產(chǎn)生豐富的片段，不能真實地反映整個基因組信息；酶切5、6 h酶切效果與4 h的無明顯差異，最終確定酶切時間為4 h，既能保證酶切完全充分，也降低了酶切過量的可能性。

酶切后的DNA片段和接頭連接后，酶切位點側(cè)翼的保護性序列就發(fā)生了改變，內(nèi)切酶EcoRⅠ和MseⅠ就不能識別酶切位點[23]。酶切產(chǎn)物連接要充分，連接時間過短，人工接頭與酶切片段不能完全連接上，會造成預(yù)擴增產(chǎn)物中缺少目的片段而使試驗失敗，本研究確定在37 ℃連接4 h。

預(yù)擴增反應(yīng)在AFLP的整個反應(yīng)體系起到承上啟下的作用。酶切和連接成功與否，只能通過預(yù)擴增進行判斷，預(yù)擴增不僅可以作為酶切和連接反應(yīng)是否完全充分的標志，而且還直接影響到選擇性擴增的結(jié)果，只有到預(yù)擴增能產(chǎn)生穩(wěn)定的片段，才能說明連接反應(yīng)成功且預(yù)擴增體系穩(wěn)定。本研究將連接產(chǎn)物稀釋10倍時預(yù)擴增產(chǎn)物產(chǎn)生較為穩(wěn)定的彌散帶，大小介于100～1 000 bp之間，且穩(wěn)定性好，不需要對預(yù)擴增體系進一步優(yōu)化。預(yù)擴增產(chǎn)物的稀釋倍數(shù)對于選擇性擴增的成敗非常重要，稀釋倍數(shù)太大導(dǎo)致帶型模糊，難以辨別；稀釋倍數(shù)太小顯帶很弱或顯不出帶，不利于條帶的讀取及多態(tài)性片斷的檢出。本研究將預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋30倍時，選擇性擴增結(jié)果較好，帶型清晰，穩(wěn)定性好，便于讀帶和統(tǒng)計。

4結(jié)論

本研究選用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/MseⅠ組合建立了馬鈴薯AFLP的最佳反應(yīng)體系，即采用試劑盒法提取DNA，37 ℃ 酶切4 h，37 ℃連接4 h，連接產(chǎn)物稀釋10倍，預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋30倍作為選擇性擴增的模板。通過建立的AFLP體系從256對引物組合中篩選出了24對擴增條帶清晰、多態(tài)性好的引物組合。

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