丹參多酚酸對大鼠腦缺血再灌注內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

王 偉

腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制未明。腦缺血引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷導(dǎo)致嚴(yán)重的后遺癥如麻痹、記憶障礙，甚至可能導(dǎo)致死亡。神經(jīng)元細(xì)胞具有高度發(fā)育的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是一種細(xì)胞器，能夠合成加工糖類和加工折疊分泌性蛋白，同時還是細(xì)胞儲存Ca2+的重要場所。有研究證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂在缺血性腦損傷中起著重要作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂將可引起細(xì)胞損傷并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[1]。丹參屬于唇齒科植物，其根莖有活血、養(yǎng)血、通心絡(luò)作用，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于心血管疾病、腦血管疾病、白血病等。注射用丹參多酚酸(Salvianolate)是應(yīng)用現(xiàn)代工藝從丹參中提取的水溶性生物成分，主要成分是丹酚酸B，大量的研究表明能通過降低大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分，提高大鼠血清VEGF與IL-10含量，保護(hù)神經(jīng)元，增加缺血半暗帶區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目[2]。但其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)系研究報告相對較少，本研究通過制備大鼠缺血再灌注模型，探討注射用丹參多酚酸的腦保護(hù)作用是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)，探討可能存在的相關(guān)機(jī)制。

1.材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組與模型制備：雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重300±20g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)將54只SD大鼠分成：Sham組、IR組以及注射用丹參多酚酸治療組(n=18)。模型制備方法:改良Zea Longa法制備大鼠右側(cè)中動脈缺血再灌注模型。Sham組手術(shù)中分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈但不插入線栓。注射用丹參多酚酸治療組、IR組線栓在缺血2小時后,抽出線栓再灌注24小時。動物蘇醒后出現(xiàn)眼裂變小、瞳孔縮小和左側(cè)軀體運(yùn)動障礙及右側(cè)Horner征即為造模成功。丹參多酚酸組在缺血2小時再灌注24小時后給予連續(xù)7天10mg/kg尾靜脈注射,每日1次。Sham組、IR組給予尾靜脈注射等量生理鹽水[3]。神經(jīng)功能評分后取腦。

1.1.2 試劑與儀器：注射用丹參多酚酸(國藥準(zhǔn)字Z20110011,天津天士力之驕藥業(yè)有限公司)，手術(shù)器械(上海手術(shù)器械廠)；氯化三苯基四氮唑(TTC,批號:030227,北京華越洋生物科技有限公司)；低溫高速離心機(jī)(美國,Thermo Fisher)；一抗兔抗大鼠(美國Santa Cruz公司)；二抗:羊抗兔(丹麥Dako公司)；倒置顯微鏡、石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)；電泳儀(北京市六一儀器廠,DYY-6C)。

1.2 方法

1.2.1 腦梗死體積測定：每組取6只大鼠，深度麻醉后迅速取腦組織，將完整腦組織放入冰箱中-20℃快速冷凍20分鐘,采用腦組織切片機(jī)以冠狀位平行切5片，厚度約為2mm。2%TTC緩沖液充分浸泡大腦切片，避光后放置40℃恒溫箱中20分鐘后，4%多聚甲醛固定，將照片輸入計(jì)算機(jī)軟件中,用分析軟件計(jì)算大腦的梗死體積百分比。梗死體積百分比=(左側(cè)正常腦組織體積-右側(cè)正常腦組織的體積)/左側(cè)正常腦組織體積×100%,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 HE染色標(biāo)本的制備：每組選取6只大鼠先用4%多聚甲醛灌流固定后，斷頭取腦，4%多聚甲醛固定標(biāo)本24小時，采用梯度乙醇脫水和石蠟包埋。將蠟塊放置在切片機(jī)上切片(厚5μm)，展片后放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?0℃烤箱中烘烤35分鐘，脫蠟、二甲苯、梯度乙醇脫蠟至純水，用蘇木素染色10分鐘，自來水沖洗；1%鹽酸乙醇分化4～6秒、返藍(lán)；伊紅染色2分鐘、沖洗，脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察。

1.2.3 Western blotting檢測大腦組織中CASPASE-12的含量： 大鼠 (n=6) 深麻醉后處死, 留取右側(cè)腦組織置于冰上，

Sham組取右側(cè)腦組織100mg， 加入1ml RIPA裂解液進(jìn)行勻漿，低溫離心機(jī)12000rmp/分，離心15分鐘，棄沉淀取上清，BCA法檢測蛋白濃度，按1:1比例加入5×SDS buffer，95°煮沸5分鐘變性后放入-80℃冰箱保存?？偟鞍咨蠘?、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗(β-actin)4℃過夜；洗膜后加二抗孵育1小時、洗膜、發(fā)光、顯影、X射線定影。

2.結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分及腦梗死體積測定 Sham組兩側(cè)大腦組織為均勻玫瑰紅色，未見有白色梗死灶；IR組和丹參多酚酸組則發(fā)現(xiàn)右側(cè)大腦組織出現(xiàn)不同程度的蒼白色梗死灶，但與IR組相比較，丹參多酚酸組腦梗死體積較小(P<0.05，見表1)。

表1 各組腦梗死體積測定(n=6)

注:與缺血再灌注組比較*P<0.05。

2.2 鏡下觀察大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞組織病理學(xué)的變化 鏡下觀察可見Sham組腦組織神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，邊界清楚，形態(tài)正常，核大而圓，核膜和核仁清晰可見。IR組神經(jīng)細(xì)胞呈缺血性改變，排列紊亂，胞體腫脹變形成多角形、核固縮；細(xì)胞壞死后的酶性分解過程繼續(xù)發(fā)展導(dǎo)致核溶解、消失。殘留細(xì)胞輪廓稱鬼影細(xì)胞(Ghost cell)。丹參多酚酸組神經(jīng)細(xì)胞缺血性改變較IR組減輕，細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯減輕，神經(jīng)細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯減輕(見圖1)。

圖1 各組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化(HE染色×200)

A：Sham組 B：IR組 C：丹參多酚酸處理組圖2 各組大鼠腦組織中Caspase-12的蛋白含量

2.3 Western Blotting檢測各組Caspase-12的蛋白含量 與Sham組相比IR組大鼠腦組織中Caspase-12蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。丹參多酚酸組較IR組表達(dá)降低(P<0.05，見圖2)。

3.討論

腦缺血時，特別是缺血再灌注過程中觸發(fā)多種不同的但又重疊的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，引起細(xì)胞凋亡或壞死，這一過程與再灌注過程中產(chǎn)生過量的自由基和細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)；有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與這一過程[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器，其在維護(hù)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和合成正確的折疊的新分泌核膜蛋白中發(fā)揮重要作用[5]。正常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生錯誤折疊蛋白量少而且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在自我修復(fù)機(jī)制；然而當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于葡萄糖剝奪、自由基損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣耗竭的這種不利條件下，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子溶度下降，依賴鈣離子的蛋白酶失活，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能，引起大量未經(jīng)折疊蛋白及錯誤折疊蛋白產(chǎn)生，聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，引起未折疊蛋白堆積，稱之為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為應(yīng)對這一反應(yīng)，一個主要途徑是通過啟動PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)eIF2激酶(PKR-like endoplasmic reticulum eIF2 kinase，PERK)抑制真核啟動因子eif2和eif4(eukaryotic initiation factor，eif)功能抑制蛋白質(zhì)翻譯生成，減少未折疊蛋白產(chǎn)生；另一個途徑是上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白Bip/GRP78和GRP94的表達(dá)，修復(fù)未折疊的蛋白質(zhì)；最后當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能難以修復(fù)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將激活Caspase-12蛋白酶系統(tǒng)啟動細(xì)胞死亡程序，以上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)反應(yīng)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[6]。短期內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激起保護(hù)作用，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激長期存在，將引起細(xì)胞凋亡[6]。Caspase-12屬于胱天蛋白酶家族一員，正常情況下，Caspase-12以前體形式存在，不具備活性；當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子耗竭、大量未折疊蛋白聚集得不到修復(fù)時Caspase-12激活[7]。Caspase-12激活后滅活抗凋亡蛋白GRP78、分解細(xì)胞結(jié)構(gòu)，誘發(fā)和執(zhí)行ER應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞死亡程序，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。朱海英等利用線栓法腦缺血再灌注損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，缺血2小時，再灌注12小時，Caspase-12逐漸表達(dá)，再灌注24小時后表達(dá)達(dá)到高峰，72小時后逐漸回落[9]，而且敲除Caspase-12的小鼠相對于野生型小鼠，對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抵抗性，但仍對其他途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組Caspase-12蛋白僅僅少量表達(dá)，而缺血再灌注組Caspase-12蛋白不僅大量表達(dá)，伴隨腦梗死面積大，細(xì)胞形態(tài)破壞，缺血細(xì)胞細(xì)胞核溶解、消失。

注射用丹參多酚酸是采用現(xiàn)代工藝提取丹參的水溶成分，經(jīng)柱層析技術(shù)分離提純的多種酚酸類化合物加工而成的凍干粉針。其主要成分是丹酚酸B，具有降低纖維蛋白原、血漿C反應(yīng)蛋白水平代謝等多種藥理作用，廣泛應(yīng)用在治療缺血性心腦血管疾病中，是有腦神經(jīng)保護(hù)作用的新一代中藥注射劑。近年來，丹酚酸B在治療腦缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制逐漸成為熱點(diǎn)而被廣泛研究，丹酚酸B加快改善保護(hù)線粒體，減少線粒體丙二醛含量，提高線粒體ATP酶活性，減少腦梗死面積[3]。我們研究發(fā)現(xiàn)，與IR組相比，丹參多酚酸組腦梗死面積減少，神經(jīng)細(xì)胞缺血性改變均較IR組減輕，細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯減輕，Caspase-12蛋白表達(dá)減少。

綜上所述，注射用丹參多酚酸可能通過下調(diào)缺血再灌注大鼠腦組織中的Caspase-12蛋白表達(dá)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。

1 劉楠，李巖，牛振華，等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2013，30(8)：757-759.

2 王淑.注射用丹參多酚酸對腦缺血大鼠VEGF、IL-10表達(dá)的影響[D].鄭州大學(xué)，2016.

3 李富強(qiáng)，王偉，馮濤，等.注射用丹參多酚酸對大鼠腦缺血再灌注線粒體ATP酶活性的影響[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2017，20(9)：23-26.

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