新輔助化療對大腸癌腫瘤細胞凋亡的影響

呂國利 白 松 李 楊

大腸癌(CRC)是常見的下消化道惡性腫瘤，據權威統(tǒng)計2007全年世界各國新發(fā)患者數約為110余萬，死亡病例高達60余萬，居所有人體惡性腫瘤的第3位[1]。中國每年新發(fā)大腸癌患者超過15萬，死亡比例達到17.4/10萬人[2]，發(fā)病比率高居全國所有人體罹患惡性腫瘤的第4位[3]，且死亡比率位居第五[4，5]。隨著中國居民生活方式、飲食習慣及工業(yè)化進程不斷變化，全國大腸癌患者發(fā)病比率大幅度上升，截至21世紀的前十年間，中國城鎮(zhèn)居民發(fā)病率上升超過31%，而在鄉(xiāng)村上升超過17%[6]。外科手術仍然是大腸癌的首要治療手段，隨著近些年新一代化療藥物不斷更新及術后化療方案的更新換代,已經為改善大腸癌患者預后及帶瘤生存質量帶來了新的福音。但是，大腸惡性腫瘤的復發(fā)率及死亡率仍居高不下。因此，新輔助化療就成為治療大腸癌病患的新方法。新輔助化療(NC)是指對大腸癌患者在行根治性手術前予化療治療。美國國家綜合癌癥網絡(NCCN)大腸癌臨床實踐指南(中國版)在2010年對大腸癌的術前化療治療限定在臨床分期為T3并淋巴結N1、N2且不論局部浸潤程度的患者，以及部分T4的晚期腫瘤患者,可通過新輔助化療手段達到降期或降級,為完整切除腫瘤手術創(chuàng)造新的機會。因此,新輔助化療在大腸癌患者治療過程中的作用發(fā)揮較大的潛力。宋傳健等[7]研究結果表明：新輔助化療可誘導大腸癌患者的腫瘤細胞發(fā)生細胞凋亡，并可以使腫瘤組織周圍血管產生炎性反應，通過使血管壁水腫、內膜增厚甚至血栓形成等方式阻斷腫瘤血供，引起腫瘤組織缺血、壞死。

因而，本研究主要針對昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸外科2009年至2011年3年間收治的60例老年大腸癌患者，采用持續(xù)靜脈泵入5-FU，LV與OXA的聯合化療方案進行術前化療，并利用TUNEL法原位凋亡細胞染色等技術檢測新輔助化療前后腫瘤細胞凋亡的情況來評估術前化療的臨床療效，進一步為大腸癌的治療提供寶貴的實驗室依據和評價標準。

1.資料與方法

1.1 樣本 收集昆明醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院胃腸外科收治的60例大腸癌患者化療前活檢組織及術后病理標本，每例均經HE染色病理組織學確診。

1.2 方法

1.2.1 TUNEL一步原位凋亡細胞檢測：①用TUNEL法處理化療前后病例切片，處理完畢后立即在切片上滴加54μl TdT酶反應液，放入濕盒中于37℃反應1小時。在TdT酶反應過程中快速加入綠色熒光探針熒光素(FITC)標記的d UTP(flurescein-d UTP)。②熒光顯微鏡下進行檢測并計數。③凋亡細胞呈現綠色熒光。

1.2.2 結果判定：400倍鏡下選取具有代表性的5個清晰視野，統(tǒng)計1000個癌組織細胞中免疫熒光凋亡的細胞總數，用百分率加以表現，即凋亡指數，以化療前后凋亡指數差值即為AI增幅比。

1.3 統(tǒng)計學方法 腫瘤細胞凋亡實驗數據的顯著性差異分析采用方差分析及t檢驗來進行，對化療前后兩組數據均數間的比較先進行方差齊性檢驗，統(tǒng)計結果方差相等時再進一步采用t檢驗；前后兩組樣本率之間的比較采用確切概率法或χ2檢驗。各組數據用SPSS 17.0版本統(tǒng)計學軟件來處理分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 化療前后凋亡指數比較 本組60例新輔助化療后大腸癌患者的凋亡指數較化療前均有不同程度的增高，增幅在0.3%～5.8%之間(具體見圖G、圖H、圖I、圖J)。

2.2 新輔助化療前后腫瘤細胞凋亡指數的比較 新輔助化療前腫瘤細胞凋亡指數最高為5.2%，最低為0.9%，平均為3.28%±1.15%，新輔助化療后腫瘤細胞凋亡指數最高為9.3%，最低為1.4%，平均為5.37%±2.07%(前后兩組配對t檢驗,t=-1.368，P=0.000<0.05)。因此我們認為新輔助化療前后大腸癌的腫瘤組織細胞的凋亡指數之間存在的差異具有統(tǒng)計學意義(見表1)。

表1 新輔助化療前后AI的比較

3.討論

大腸癌是臨床最為多見的損害人們健康和生命的惡性腫瘤之一。世界范圍內大腸癌發(fā)病概率正以2%的年增長速度增加，在亞洲以外的歐美等國家其發(fā)病率略低于肺癌[8,9]，并且有研究者預測大腸癌極有可能成為全球發(fā)病率第一的腫瘤[10]。在亞洲和美洲，大腸癌以直腸癌為主，并且在我國具有獨特的特征，年輕人直腸癌發(fā)病率較高，預后較差，且漏診率和誤診率也很高[11,12]。經過半個多世紀對大腸癌發(fā)生機制的研究，有學者就證實其發(fā)生發(fā)展機制是一個多環(huán)節(jié)、多步驟的病理過程[13]。臨床上對大腸癌的治療以手術為主，但由于早期診斷方法的欠缺及抗腫瘤轉移治療的靶點，對于大腸癌晚期患者治療效果較差[14]。近年，新的化療藥物及化療方案的出現使大腸癌患者生存期的延長及生存質量的提高得到了較好的獲益。即使根治性手術及全身的術后輔助化療的臨床應用,大腸癌患者的復發(fā)率及死亡率仍然比較高。所以，新輔助化療自然成了提升大腸癌治療效果、減少其轉移、降低其復發(fā)率和病死率的新手段。

3.1 新輔助化療藥物及方案的選擇 大腸癌的輔助化療方案是以氟尿嘧啶(5-FU)為基礎的。ChauI等[15]人發(fā)現，持續(xù)靜脈泵入5-FU+四氫葉酸(LV)與靜脈滴注方案比較療效有顯著性差異,而不良反應相對較小。近年來奧沙利鉑(OXA)在大腸癌患者化學治療中的療效已得到廣泛認可。在Ⅱ期、Ⅲ期大腸癌患者中應用FOLFOX4方案輔助化療療效的臨床試驗已在歐洲多中心隨機對照試驗(MOSA IC)得到了驗證[16]，并在美國臨床腫瘤協會(簡稱ASCO)2002年年會上對該方案作為輔助化療療效的安全性做了首次報道。隨后在ASCO年會上也陸續(xù)對應用FOLFOX4方案的大腸癌患者的3年、5年無病生存率以及Ⅲ期患者中6年總生存率均優(yōu)于單純應用5-FU/LV的患者做出了詳盡的報道，表現出了奧沙利鉑的臨床治療價值，進一步證實了大腸癌患者術后應用FOLFOX 4方案在大腸癌患者中的優(yōu)勢。美國乳腺與腸道外科輔助治療研究組(簡稱NSABP)在2007年的C207研究中也顯示出單純靜脈應用5-FU/LV的臨床療效差于FOLFOX4方案,并且使大腸癌患者的無病生存期得到明顯延長[17]。2009年美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南(中國版)對大腸癌患者的標準化療方案推薦為FOLFOX 4方案。近年來我國已廣泛應用此方案治療大腸癌患者。因此本研究亦采用FOLFOX4方案并通過持續(xù)靜脈泵入作為大腸癌患者的新輔助化療手段。

3.2 新輔助化療后癌組織細胞凋亡的變化 腫瘤的發(fā)生發(fā)展與人體細胞凋亡有密切關聯。人為因素抑制細胞凋亡，就會使組織細胞的代謝周期延長，正常的細胞周期破壞，進而形成過度的細胞積累。凋亡率降低是腫瘤細胞長期存活的關鍵所在，細胞凋亡率降低將導致腫瘤的發(fā)生[18,19]。目前大部分的腫瘤治療措施如放化療、免疫治療、基因治療等均可激活癌細胞凋亡信號傳導途徑[19,20]。Sturm等則發(fā)現新輔助化療能使腫瘤細胞的凋亡增加[21]。

本課題組通過對我院收治的60例大腸癌患者利用TUNEL法原位凋亡細胞染色技術對比新輔助化療前后的癌細胞凋亡情況研究后發(fā)現：60例大腸癌患者新輔助化療后其細胞凋亡指數相比化療前均有不同程度的增高；具體來說，新輔助化療前大腸癌組織細胞凋亡指數最高為5.2%，最低為0.9%，平均為(3.28%±1.15%)，新輔助化療后腫瘤細胞凋亡指數最高為9.3%，最低為1.4%，平均為(5.37%±2.07%)，增幅在0.3%～5.8%之間(P=0.000<0.05)。本組的研究結果與任峰[22]等相關研究結果相當或略高，說明新輔助化療能顯著誘導人體大腸癌腫瘤細胞的凋亡。因此我們認為：新輔助化療在控制和延緩大腸癌進展方面發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，給予大腸癌患者新輔助化療可以使腫瘤細胞的凋亡率增加，為今后的腫瘤學研究提供了可信的實驗室數據。但大腸癌患者預后的影響因素較復雜，各種影響因素的確定還需要大樣本多中心的臨床對照研究。確定新輔助化療患者的長期生存狀況及該方法的優(yōu)勢，仍需長時間的臨床觀察及隨訪。

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