蛤蚧不同提取液對(duì)衰老模型小鼠免疫功能的影響

吳麗麗 周 蓓 陳 豪 馮麗婷 何金桂

蛤蚧(GekkogeckoLinnaeus)為脊索動(dòng)物門爬行綱壁虎科動(dòng)物，又名蛤蟹、仙蟾、蚧蛇、大壁虎、德多等，首載于《雷公炮炙論》，《本草綱目》記載：蛤蚧咸性平、歸肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肺益腎、納氣定喘、助陽益精的功效，用于虛喘氣促、勞嗽咳血、陽痿遺精。蛤蚧具有多方面的藥理作用，而現(xiàn)代研究多以對(duì)其原藥材的醇提物進(jìn)行分析，如林安平等[1]研究表明蛤蚧乙醇提取液能顯著提高IGF-1和Inh A在大鼠卵巢中的表達(dá)，從而改善大鼠卵巢功能。張勝昌等[2]研究表明蛤蚧乙醇提取液可能誘導(dǎo)骨微環(huán)境中TGF-β1表達(dá)增加，有效預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生。此外，多項(xiàng)研究表明[3～6]，蛤蚧對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫功能低下小鼠、荷瘤小鼠具有抑瘤、提高免疫等作用。但鮮少見有關(guān)于蛤蚧對(duì)衰老模型小鼠免疫功能影響的報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)通過觀察蛤蚧乙醇提取液以及仿生酶解液對(duì)D-半乳糖(D-gal)誘導(dǎo)衰老小鼠免疫功能的影響，以期為進(jìn)一步研究蛤蚧增強(qiáng)機(jī)體免疫、延緩衰老提供依據(jù)。

1.材料

1.1 藥材 蛤蚧干燥體，購買于玉林藥材市場，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室田慧教授鑒定其為壁虎科動(dòng)物蛤蚧(Gekko gecko Linnaeus)。清理蛤蚧表面灰塵，去掉頭部，置干燥箱內(nèi)60℃烘干后，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，使全部蛤蚧粉末能通過二號(hào)篩，混合均勻，備用。

1.2 動(dòng)物 清潔級(jí)2～3月齡昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK桂2016-0504。實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)入動(dòng)物房適應(yīng)3天后開始實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物級(jí)環(huán)境設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室按晝夜節(jié)律采光12小時(shí)，通風(fēng)良好，室溫保持在20℃～25℃左右，定期消毒。

1.3 儀器 中草藥粉碎機(jī)(型號(hào)：LD-500，天津市泰斯特儀器有限公司)；電熱真空干燥箱(型號(hào)：DZF-6000系列，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；超聲波清洗器(型號(hào)：KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司)；精密電子天平(型號(hào)：SQP，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(型號(hào)：DKS-26，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；離心機(jī)(型號(hào)：TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠)；微孔板檢測儀(型號(hào)：Infinite M200 PRO，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司)。

1.4 試劑 D-半乳糖(Sigma公司，批號(hào)：G6404)，胃蛋白酶(1:3000，Amresco公司，批號(hào)0685)，胰蛋白酶(1:250，Amresco公司，批號(hào)：B0016K040100)，維生素E軟膠囊[國藥控股星鯊制藥(廈門)有限公司，批號(hào)：10853003]，IL-2試劑盒(Bio-Swamp公司，批號(hào)：201606)，其余所用化學(xué)試劑、藥品均為分析純，水為超純水。

2.方法

2.1 藥液的制備 ①蛤蚧乙醇提取液：精密稱取蛤蚧粉末40.5g，加入20%乙醇溶劑1000ml，置于超聲波清洗器中，超聲溫度為35℃，超聲60分鐘后過濾上清液，殘?jiān)偌酉嗤w積的溶劑進(jìn)行超聲，合并所得上清液，然后濃縮至65ml，即為蛤蚧乙醇提取液。②蛤蚧仿生酶解液[7]：精密稱取蛤蚧粉末40.5g，放入1000ml燒杯中，加入1000ml的蒸餾水，在40℃下水浴提取15分鐘，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0，在37℃下水浴保溫10分鐘后加入1%胃蛋白酶，在37℃下酶解2小時(shí)，然后加熱到65℃將酶滅活；然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值為8.0，在50℃下水浴保溫10分鐘后加入1%胰蛋白酶，在50℃下酶解3小時(shí)，然后加熱到65℃將酶滅活。在酶解液冷卻至室溫后，過濾，濃縮至65ml，即為蛤蚧仿生酶解液。③維生素E：取維生素E 50mg，溶于10ml食用油中制成濃度為5mg/ml的溶液，備用。

2.2 分組與給藥 將50只小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、維生素E組、乙醇提取液組、仿生酶解液組，共5組，每組10只。正常對(duì)照組按0.1ml/10g頸背部皮下注射0.9%生理鹽水，其余各組小鼠按120mg/kg、給藥劑量0.1ml/10g頸背部皮下注射D-gal，每日1次，連續(xù)注射6周。造模后，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等體積0.9%生理鹽水，維生素E組、乙醇提取液組和仿生酶解液組按0.1ml/10g分別灌胃對(duì)應(yīng)藥液，連續(xù)給藥21天。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水，每3天稱重1次，按體重調(diào)整給藥劑量。

3.檢測指標(biāo)及檢測方法

3.1 小鼠脾臟和胸腺指數(shù)測定 摘眼球取血前，準(zhǔn)確稱定各組小鼠的體重，摘取眼球取血后頸部脫臼處死，摘除脾臟和胸腺，用預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)沖洗，用濾紙吸干，用電子天平稱其重量，計(jì)算各臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)。

3.2 檢測小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2濃度 取血后，自然靜置30分鐘，然后以3000r/min離心10分鐘，取上清液即為血清，再按ELISA試劑盒說明書操作，測定血清中細(xì)胞因子IL-2的濃度。

4.結(jié)果

4.1 小鼠一般行為學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)期間每天觀察小鼠一般行為改變，包括進(jìn)食、活動(dòng)、毛色改變等情況，并每隔3天稱小鼠體重1次，觀察各組小鼠體重變化情況。連續(xù)皮下注射D-gal 6周，小鼠毛色逐漸枯槁沒光澤，皮膚彈性變差，精神萎靡，活動(dòng)減少，倦怠嗜睡，進(jìn)食減少，飲水量下降，體重減輕，呈現(xiàn)出衰老體征。如表1可知，各組小鼠初始體重?zé)o明顯差異(P>0.05)；連續(xù)皮下注射D-半乳糖6周后，與正常對(duì)照組相比，其余各組小鼠的末次體重和增重均顯著降低(P<0.05)。

4.2 蛤蚧不同提取液對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響 結(jié)果見表2，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，維生素E組、乙醇提取液組、仿生酶解液組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.05，P<0.01)，而各給藥組之間無明顯差異(P>0.05)。

表1 D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠體重變化(n=10)

注：與正常對(duì)照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

表2 各組小鼠脾臟和胸腺指數(shù)比較

注：與正常對(duì)照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型對(duì)照組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

4.3 蛤蚧不同提取液對(duì)D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠細(xì)胞因子IL-2的影響 結(jié)果見表3，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清中IL-2水平顯著下降(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，維生素E組和仿生酶解液組小鼠血清中IL-2水平均升高，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但兩組之間無顯著性差異(P>0.05)；乙醇提取液組血清中IL-2水平有一定程度的提高，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組小鼠血清細(xì)胞因子IL-2的水平(n=10)

注：與正常對(duì)照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型對(duì)照組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

5.討論

免疫衰老學(xué)說作為衰老機(jī)制的經(jīng)典學(xué)說之一，認(rèn)為免疫系統(tǒng)是衰老過程的主要調(diào)節(jié)系統(tǒng)之一，最初在于增齡導(dǎo)致的胸腺萎縮，進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫、體液免疫以及天然免疫發(fā)生不同程度的改變[8]。胸腺作為機(jī)體的中樞免疫器官，是各種T細(xì)胞分化成熟的場所，其功能狀態(tài)的正常與否，直接關(guān)系到到機(jī)體整體免疫情況的好壞。而脾臟作為人體最大的外周免疫器官，有大量的淋巴樣組織產(chǎn)生淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其次脾臟還是機(jī)體的“血庫”，能儲(chǔ)存體內(nèi)的血液以及發(fā)揮濾血的作用，主要是脾內(nèi)有許多吞噬細(xì)胞能夠清除經(jīng)過脾內(nèi)血液中的衰老血紅細(xì)胞，從而參與機(jī)體免疫機(jī)制。IL-2是一種在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要而復(fù)雜作用的細(xì)胞因子，既可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)免疫功能，又能限制T細(xì)胞反應(yīng)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫耐受，故可用于治療腫瘤和感染性疾病及自身免疫性疾病[9]。因此通過測定小鼠胸腺指數(shù)、脾腺指數(shù)和IL-2來指示小鼠的免疫功能。

D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型由于其操作簡便、造模時(shí)間較短、模型易于建立、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，且表現(xiàn)出與自然衰老動(dòng)物相似的衰老體征，已成為國內(nèi)較公認(rèn)的衰老模型。曹湘博等[10]研究表明，給小鼠皮下注射D-半乳糖40mg/(kg·d)，連續(xù)給藥10天，其胸腺指數(shù)、T細(xì)胞增殖活性以及IL-2，IFN-γ，TNF三種TH1型細(xì)胞因子活性均明顯低于正常對(duì)照組，表明D-半乳糖可誘導(dǎo)小鼠免疫功能降低。董會(huì)萍[11]對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠的劑量進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在120～150mg/(kg·d)劑量范圍，D-半乳糖能夠引起抗氧化酶系統(tǒng)活力的下降，同時(shí)造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間認(rèn)知能力的損傷，而低劑量75mg/(kg·d)作用不明顯。此外，高劑量條件[1000mg/(kg·d)]雖然也能夠引起上述生理、生化和行為改變，但是在該劑量條件下，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫力明顯下降，死亡率較高，且自主活動(dòng)減少，不利于認(rèn)知、情緒相關(guān)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行及結(jié)果的判定，因此選擇120～150mg/(kg·d)作為建立D-半乳糖衰老動(dòng)物模型的合理劑量范圍。

中醫(yī)認(rèn)為，腎為先天之本，藏先天之精，主生殖，為人體生命之本原。腎陽為一身陽氣之本，能推動(dòng)和激發(fā)臟腑的各種機(jī)能，溫煦全身臟腑形體官竅。因此，認(rèn)為蛤蚧可通過補(bǔ)腎、助陽益精的功效達(dá)到延緩機(jī)體衰老的目的。羅謀倫等[12]研究表明蛤蚧乙醇提取物可延長雌雄果蠅的平均壽命及半數(shù)死亡時(shí)間，提高雌雄果蠅飛翔活力及耐寒力，延長小鼠的缺氧存活時(shí)間，證實(shí)蛤蚧具有一定的抗衰老作用。薛長江等[13]研究表明蛤蚧醇提液能顯著提高18月齡衰老大鼠心肌組織自由基清除能力達(dá)到延緩衰老的作用。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，蛤蚧具有抗炎、平喘、抗應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老等方面的作用主要與蛤蚧體內(nèi)含有大量的功能蛋白密切相關(guān)。而隨著現(xiàn)今對(duì)蛋白質(zhì)類藥物的研究，多集中在將大分子蛋白質(zhì)變成分子量較小的多肽，從而尋找活性中心，以達(dá)到更好的藥效。而仿生酶解法是先通過胃蛋白酶酶解，再經(jīng)過胰蛋白酶酶解，模擬人體消化過程，可使蛤蚧中的蛋白質(zhì)類成分酶解成小分子肽，能提高蛤蚧中物質(zhì)基礎(chǔ)的溶出率。因此，本試驗(yàn)比較研究乙醇提取和仿生酶解蛤蚧對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠免疫功能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛤蚧的仿生酶解液和乙醇提取液均能提高D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)以及血清中IL-2水平，且仿生酶解液增強(qiáng)免疫作用優(yōu)于乙醇提取液，提示蛤蚧通過仿生酶解法提取，可有效提高蛤蚧多肽溶解率，進(jìn)而顯著增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，為進(jìn)一步研究蛤蚧延緩衰老的機(jī)制提供借鑒。

1 林安平，胡麗娜，李聰.蛤蚧乙醇提取液對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].兒科藥學(xué)雜志，2007，13(3)：13-15,21.

2 張勝昌，白鷺，藍(lán)玲，等.蛤蚧乙醇提取液影響去勢(shì)大鼠脛骨TGF-β1表達(dá)的研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27(2)：191-194.

3 席瑋，謝裕安，楊帆，等.蛤蚧肽對(duì)荷瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用[J].內(nèi)科，2011，6(1)：5-8.

4 楊帆，席偉，謝裕安，等.蛤蚧肽對(duì)小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28(3)：342-344.

5 周蓓，陳豪，吳麗麗，等.蛤蚧對(duì)S(180)荷瘤小鼠Th1/Th2免疫細(xì)胞平衡的影響[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2016，12(9)：11-13.

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8 史進(jìn)方，顧國浩，張學(xué)光.免疫衰老及其免疫學(xué)預(yù)警指標(biāo)[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2005，25(4)：347-349.

9 常瑞雪，顏天華，王秋娟，等.白細(xì)胞介素-2及其相關(guān)藥物的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展，2011，35(1)：1-7.

10 曹湘博，于樂洋，常雅萍.D-半乳糖亞急性中毒擬衰老模型鼠免疫功能及生化指標(biāo)變化的研究[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(7)：382-385.

11 董會(huì)萍.D-半乳糖衰老模型建立及模型小鼠認(rèn)知功能障礙的研究[D].大連理工大學(xué)，2008.

12 羅謀倫，謝干瓊，趙一.蛤蚧抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究[C].全國抗衰老藥物學(xué)術(shù)年會(huì)資料匯編，1990：98-103頁.

13 薛長江，周小棉，陳國千，等.蛤蚧對(duì)大鼠心肌抗衰老作用的影響[J].中藥藥理與臨床，1992，8(2)：21-24.