單純皰疹病毒型和型核酸擴(kuò)增試劑盒反應(yīng)體系的優(yōu)化

吳穎瑩

【摘 要】目的：優(yōu)化單純皰疹病毒1型和2型核酸擴(kuò)增試劑盒PCR反應(yīng)體系，提高其靈敏度；方法：在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)液配方的基礎(chǔ)上，分別對擴(kuò)增條件和反應(yīng)體系中主要成分的濃度進(jìn)行了優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)SLAN-96P熒光定量PCR儀，測定熒光強(qiáng)度；結(jié)果：確定了PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增條件以及主要成分的濃度比例；結(jié)論：本研究所確定的PCR反應(yīng)體系靈敏度高專屬性好。

【關(guān)鍵詞】皰疹病毒1型；皰疹病毒2型；PCR優(yōu)化

Optimization of reaction system of herpes simplex virus type 1 and 2 nucleic acid amplification test kit

[Abstract] Objective：To optimize the herpes simplex virus type 1 and 2 PCR reaction system， and to obtain a more efficient and sensitive kit. Methods：Based on the formula of PCR reaction base fluid， optimize the amplification conditions and the concentration of main components in the reaction system， and amplify the reaction parameters. The fluorescence intensity was determined by SLAN-96P fluorescence quantitative PCR. Results：Determine the amplification conditions of the PCR reaction system and the concentration ratio of the main components. Conclusion：The sensitivity and specificity of the PCR reaction system determined by this study are good.

[Key words] herpes virus type 1， herpes virus type 2， PCR， optimization

【中圖分類號】R545.14 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-6851（2018）01-00-01

單純皰疹病毒（Herpse simplex virus， HSV）是一類嚴(yán)重危害人類健康、引起皮膚病、性病等疾病的常見病原體。HSV是有包膜的雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒科，分為HSV-1和HSV-2兩個血清型[1]。我國的HSV感染發(fā)病率迅速上升，近年HSV-1型的感染顯著增多，因此需要對單純皰疹病毒感染進(jìn)行快速靈敏準(zhǔn)確的診斷。隨著現(xiàn)代核酸技術(shù)的發(fā)展，建立在基因水平上的核酸擴(kuò)增技術(shù)（PCR）由于其高敏感性和高特異性在單純皰疹病毒的臨床檢測中得到廣泛應(yīng)用[2]。單純皰疹病毒1型和2型核酸擴(kuò)增雙檢試劑盒（PCR-熒光探針法）是檢測單純皰疹病毒1型和2型的一種熒光定量PCR檢測試劑。它采用了高靈敏的TaqMan分子探針，使特異性和靈敏度顯著提高，直接探測PCR過程中熒光信號的變化。檢測過程中反應(yīng)體系全封閉、靈敏度高、特異性強(qiáng)，為臨床上各種皰疹的早期診斷提供分子生物學(xué)上的參考依據(jù)[3]。試劑盒由PCR反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、內(nèi)標(biāo)模板、RNA提取液等組成。為了得到更高效靈敏的試劑盒，本研究對試劑盒PCR反應(yīng)體系的主要組分及反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，使其擴(kuò)增達(dá)到更好的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

滅菌水，生理鹽水，Taq 酶及PCR Buffer、dNTPs購自TaKaRa公司，單純皰疹病毒1型引物、探針序列為5'-AACCACCAAGGAGCTCAAGAAC-3'；與5-（ROX）-CCACCAACCCGGACGCGTCC-（BHQ1）-3。單純皰疹病毒2型引物、探針序列為5'-GCTTCCTCATCGCGTACCAG-3'與5-（ FAM）-CCTCCTCAGCAACACGCTCGCCG-（ BHQ1） -3均購自生工生物工程（上海）有限公司，純度99%；TaqMan探針購自生工生物工程（上海）有限公司，純度99%。美國Stratagene實(shí)時熒光定量PCR儀SLAN-96P。

1.2 方法

1.2.1 擴(kuò)增條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)：采用2步擴(kuò)增法，變性溫度和時間設(shè)為預(yù)變性95℃，3min，變性95℃，10s。依據(jù)引物及探針的理論Tm的計(jì)算，同時根據(jù)擴(kuò)增的熒光信號及擴(kuò)增的Ct比較擴(kuò)增的效果，退火溫度分別設(shè)置為56℃，58℃，60℃反應(yīng)1分鐘，40個循環(huán)，按表1 加入各反應(yīng)組分及模板，離心分裝后置于PCR儀中，依法操作，收集熒光信號[4][5]。

1.2.2 HSV1引物濃度的優(yōu)化：以HSV1&2抽提的DNA作為模板，純化水作為空白對照，在固定其它組分濃度的前提下，改變加入PCR反應(yīng)管中的引物量，設(shè)置HSV1引物濃度分別為0.20、0.30、0.40、0.50、0.60μM的5個濃度梯度。分別置于PCR儀中，依法操作，收集熒光信號

1.2.3 HSV1探針濃度的優(yōu)化：以HSV1&2抽提的DNA作為模板，滅菌雙蒸水作為空白對照，在固定其它組分濃度的前提下，通過改變加入PCR反應(yīng)管中的HSV1探針的量，設(shè)置HSV1探針濃度分別為0.12、0.16、0.20、0.24、0.28μM的5個濃度梯度，分別置于PCR儀中，依法操作，收集熒光信號

1.2.4 HSV2引物濃度的優(yōu)化：以HSV1&2抽提的DNA作為模板，純化水作為空白對照，在固定其它組分濃度的前提下，改變加入PCR反應(yīng)管中的引物量，設(shè)置HSV2引物濃度分別為0.20、0.30、0.40、0.50、0.60μM的5個濃度梯度，分別置于PCR儀中，依法操作收集熒光信號endprint

1.2.5 HSV2探針濃度的優(yōu)化：以HSV1&2抽提的DNA作為模板，滅菌雙蒸水作為空白對照，在固定其它組分濃度的前提下，通過改變加入PCR反應(yīng)管中的探針的量，設(shè)置HSV2探針濃度分別為0.12、0.16、0.20、0.24、0.28μM的5個濃度梯度，分別置于PCR儀中，依法操作，收集熒光信號

1.2.6 內(nèi)標(biāo)引物濃度的優(yōu)化：以HSV1抽提的DNA作為模板，純化水作為空白對照，在固定其它組分濃度的前提下，改變加入PCR反應(yīng)管中的內(nèi)標(biāo)引物量，設(shè)置內(nèi)標(biāo)引物濃度分別為0.06、0.08、0.10、0.12、0.14μM的5個濃度梯度，分別置于PCR儀中，依法操作，收集熒光信號

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果見圖1-圖3，曲線虛線表示HSV1擴(kuò)增曲線，實(shí)線表示HSV2擴(kuò)增曲線，點(diǎn)劃線表示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增曲線。由圖可以看出，三種反應(yīng)條件中，第三種得到的熒光信號強(qiáng)，且曲線呈S型，因此本實(shí)驗(yàn)選擇最佳退火溫度為60℃。并最終確定的反應(yīng)條件為：50℃ 2分鐘；95℃ 3分鐘；95℃ 10秒、60℃ 1分鐘，40個循環(huán)。

2.2 在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)液配方的基礎(chǔ)上，本研究分別對反應(yīng)體系中主要成分的濃度進(jìn)行了優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)SLAN-96P熒光定量PCR儀上機(jī)后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-圖8所示：

由圖4和圖6可知隨著HSV1和HSV2引物濃度的增高，Ct值基本一致。當(dāng)HSV1和HSV2引物濃度為0.40μM時，反應(yīng)結(jié)束后的熒光信號強(qiáng)度最高，確定HSV1和HSV2引物的濃度均為0.40μM。由圖5和圖7所知，5種不同濃度的HSV1和HSV2探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增，當(dāng)探針的濃度為0.20μM時，反應(yīng)結(jié)束后的熒光信號強(qiáng)度最強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)確定的最佳HSV1和HSV2探針濃度均為0.20μM。由圖8可以看出，隨著引物濃度的增高，Ct值基本一致。當(dāng)內(nèi)標(biāo)引物為0.10μM時，內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增曲線呈S型，且熒光信號強(qiáng)度較強(qiáng)。最終確定內(nèi)標(biāo)引物的濃度為0.10μM。

3 討論

在本項(xiàng)研究中，單純皰疹病毒1型的TaqMan探針的基團(tuán)設(shè)計(jì)為ROX，ROX的吸收光波長為575 nm，發(fā)射光波長為602 nm。單純皰疹病毒2型的TapMan探針的基團(tuán)設(shè)計(jì)為FAM，F(xiàn)AM的吸收光波長為494nm，發(fā)射光波長為525nm，因此彼此不會相互干擾。

本研究基于TaqMan探針技術(shù)與實(shí)時熒光PCR儀的結(jié)合，對實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系中主要組分用量及濃度進(jìn)行了優(yōu)化并得到最佳處方；在退火溫度上進(jìn)行了梯度試驗(yàn)摸索，退火溫度設(shè)置為60℃，退火時間設(shè)置為1min，依次反復(fù)試驗(yàn)，從而使HSV1的檢測均能在同一應(yīng)條件下進(jìn)擴(kuò)增而達(dá)到較好的效果。本試劑盒經(jīng)反應(yīng)體系的優(yōu)化后，檢測更佳高效，靈敏度更好。

參考文獻(xiàn)

侯熙德. 神經(jīng)病學(xué)[M]. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 1986. 138- 139.

楊天嬌， 朱啟镕. 新生兒單純皰疹病毒感染的研究進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)學(xué)兒科學(xué)分冊. 2004， 31（4）： 128-129.

吳強(qiáng)， 楚雍烈， 房益蘭. 單純皰疹病毒分子生物學(xué)分型方法的研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào)199219（3）： 163-167.

賴迪輝，朱威，連石. 單純皰疹病毒實(shí)驗(yàn)室檢測方法的研究進(jìn)展[J]. 中國計(jì)劃生育學(xué)雜. 2010， 6： 380-381

賴維 蘇向陽，熒光多重實(shí)時PCR檢測單純皰疹病毒[J].中華皮膚科雜志. 2004，37（5）：273-275endprint