中藥血清藥理學及血清藥物化學研究進展*

盧 磊 劉曉丹 張培影

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬徐州市中醫(yī)院，江蘇 徐州 221000；2.江蘇省徐州市中心醫(yī)院，江蘇徐州 221000）

中藥及中藥復方所含成分復雜，干擾因素多，藥效物質(zhì)基礎不明，藥理作用機制、代謝過程等問題難以完全解釋清楚，缺乏可靠的藥理學、毒理學數(shù)據(jù)，使得中藥單方及中藥復方制劑的藥效學物質(zhì)基礎無法客觀的表達，也直接造成了中醫(yī)藥制劑無法與國際質(zhì)量標準相接軌，導致中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀窘迫［1］。目前國內(nèi)外主流的中藥藥效物質(zhì)基礎研究模式是將復雜體系中所含化學成分采用諸如色譜法、重結晶法等分離后進行活性導向下的追蹤分離或逐個進行藥效學活性測試［2］，上述方法分離所得的單體成分或成分群是否為真正的中藥藥效物質(zhì)基礎目前爭議較大［3］。其一，中藥及其復方所含化學成分在生物體內(nèi)環(huán)境（如pH、腸道菌群、肝藥酶）下多發(fā)生復雜的代謝或生物轉化，分離所得化合物可能只是活性成分的前體，例如番瀉苷屬于蒽酮苷類藥化合物，本身無瀉下作用，口服后小腸吸收率低，但在大腸腸道微生物的作用下生成苷元而發(fā)揮瀉下作用［4］，國外苦杏仁苷注射曾用于腫瘤治療，而改用口服后出現(xiàn)較大的毒性反應，其根源為腸道菌群中的β-葡萄糖苷酶將苦杏仁苷水解產(chǎn)生毒性的氫氰酸，因此腸道菌群的代謝是苦杏仁苷口服致中毒反應的關鍵環(huán)節(jié)［5］；其二，中藥及其復方所體現(xiàn)的治療效果往往是多組分、多靶點、多環(huán)節(jié)的綜合結果，采取成分分離的方法追蹤活性物質(zhì)基礎，整合作用消失，割裂了中藥的整體性［6］。因此，探索符合中醫(yī)辨證思維和整體觀的研究思路以及適合中藥復雜體系的研究方法，闡明中藥及其復方藥效物質(zhì)基礎、配伍機理及作用機制，是貫穿中藥研究始終的關鍵科學問題和主要內(nèi)容。

1 血清藥理學及血清藥物化學研究方法的提出

上世紀80年代初，著名的日本藥理學家田代真一首次提出了血清藥理學這一創(chuàng)新思路。他認為中藥制劑口服吸收后，在體內(nèi)經(jīng)過胃腸道菌群代謝和排泄過程而發(fā)揮治療作用，因而中藥及其復方中具有生物活性的成分——藥效物質(zhì)基礎是中藥經(jīng)過人體生物轉化之后的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物吸收入血后與血漿蛋白結合并通過血液的流動到達靶標器官及組織。因此傳統(tǒng)的體外藥效學實驗方法如直接將中藥水提液或水提液經(jīng)細菌代謝后的成分直接加入離體的組織及細胞反應體系中不如整體動物口服或靜脈給藥后檢測其含藥血清化學成分及生物活性更合理。自上世紀90年代國內(nèi)學者王喜軍提出“中藥血清藥理學”以來，這一方法在中醫(yī)藥藥效物質(zhì)基礎研究中被廣泛重視及應用。

2 中藥血清藥理學概念、方法及應用

中藥血清藥理學是指將中藥及復方制劑經(jīng)口灌胃給予動物后收集其血清，血清中含有中藥經(jīng)過動物機體生物轉化的代謝產(chǎn)物及一些內(nèi)源性物質(zhì)，將此含藥血清取代中藥復方煎煮劑、丸散劑等加入離體的組織器官或細胞體系中，并對其進行藥效學及機制研究的體外研究方法。該方法對于諸如中藥及復方這種復雜化學體系的生物活性成分的發(fā)現(xiàn)與研究較為合適，它克服了中藥粗制劑直接加入反應體系中進行體外實驗的缺點，能從一定程度上反映中藥方劑復雜體系與生物機體的復雜生命系統(tǒng)的相互作用的規(guī)律。相比于直接以中藥復方制劑干預的體外實驗，予含藥血清進行的體外研究，其結果更具科學和可信度。近年來，血清藥理學在中醫(yī)藥研究中的應用被廣泛接受，并展現(xiàn)出其特有的優(yōu)勢［7］：首先它從實驗方法學上克服了體外實驗不能直接觀察到的中藥復方經(jīng)體內(nèi)吸收、代謝等整體藥理效應，反映了成分與成分、成分與機體的協(xié)同作用；其次對含藥血清中化學成分進行藥效學和藥代學等進行研究，客觀合理地反映出中藥復方的藥效學基礎；第三可以用來驗證一些中醫(yī)學基礎理論，為探討中藥復方作用規(guī)律提供新思路。

血清藥理學實驗方法避免了中藥復方煎煮及丸散等粗制劑型直接進行體外藥物研究結果所產(chǎn)生的影響；而且經(jīng)過動物的吸收代謝等過程，其血清成分可更直接地反映中藥復方制劑的藥理作用，其對中藥復方療效和機制的闡述也更具科學性。因此，隨著這一實驗方法的不斷完善和改進，其在中醫(yī)藥基礎研究的各個領域被廣泛應用，為實現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化與國際接軌提供了循證依據(jù)手段。

然而血清藥理學也存在著許多不足，如實驗動物的選擇、給藥劑量、時間、血清添加量等方面也對實驗結果產(chǎn)生或多或少的影響，但隨著對其理論及實驗的改進和研究，這些問題可以通過一系列實驗手段解決或改善。

2.1 實驗動物選擇 目前對于制備含藥血清，我們常采用大鼠、家兔等動物。然而實驗研究中，由于動物種屬的不同，其血清的內(nèi)源性成分也不盡相同，為了盡可能減少不同種屬動物血清在生理生化等方面的不同，減少因此而引起的免疫反應［8］，要盡量選擇與人類生物學特征相近的物種［9］，否則其研究會出現(xiàn)較大的差距，影響實驗結果的客觀性。此外，為避免種屬差異，在一些離體器官、組織、細胞等進行體外實驗中，還應盡量選擇與實驗動物統(tǒng)一種屬的動物來制備含藥血清，這樣亦可以減小因上述差異而造成的免疫反應，提高研究的可靠性。

2.2 給藥劑量 實驗動物確定以后，需要對動物給藥劑量進行研究。給藥劑量可直接影響到含藥血清中的藥物的濃度及含量。但是，對于給藥劑量的大小也應嚴格控制，既不能過大、也不能過小。在以含藥血清為載體的研究中，除了將含藥血清加入體外研究體系，還因需要額外加入一定體積的提供離體器官、組織或細胞營養(yǎng)和能量的培養(yǎng)基而使整個研究體系的藥物濃度降低。在體外實驗中，藥物的濃度會直接影響實驗的結果，當培養(yǎng)體系中的藥物濃度低于體內(nèi)實驗要求的有效藥物濃度時，有可能導致“假陰性”結果的出現(xiàn)。同時，考慮到中藥復方制劑濃縮后藥液的黏稠度、動物的胃腸道對濃縮藥液的最大接受量以及過大藥物劑量而導致的毒副作用，所以灌胃給藥的最大劑量也應嚴格控制。因此有學者提出可以按照一定的公式計算給藥量，給藥劑量=臨床用藥量×動物等效劑量系數(shù)×培養(yǎng)體系內(nèi)血清的稀釋比例［10］。然而不同藥物的吸收代謝、半衰期等因素差異，因此給藥劑量的選擇也有差異。因此對于不同藥物，必須通過合理的預實驗，尋找最佳的給藥劑量，才能有效降低實驗誤差，保證結果的有效性和科學性。

2.3 給藥方案 因為藥物本身代謝吸收、半衰期等的差異性，因此在對合適的給藥劑量進行確認后，還需對適宜的給藥方案進行研究。需要考慮兩方面因素：是否需要禁食；給藥間隔及持續(xù)時間。眾所周知，口服的中藥復方制劑和食物的體內(nèi)過程共用同一條通道——消化道，兩者合用時勢必會發(fā)生相互作用。一是食物的性質(zhì)會影響某些中藥成分的吸收，例如根據(jù)相似相溶原理，高脂飲食能顯著提高脂溶性成分的吸收，提高其生物利用度；食物中的某些含多價金屬離子的礦物質(zhì)可能與藥物成分發(fā)生螯合作用，從而影響成分的吸收。二是食物可能短時間改變胃腸道理化性質(zhì)，影響機體的生理功能，如胃液pH值變化導致弱酸性及弱堿性中藥成分吸收的改變；食物促進膽汁的分泌，導致某些具有肝腸循環(huán)特征的成分吸收增加等。因此，食物和藥物的相互作用可能導致中藥有效成分血藥濃度達到血清藥理學實驗要求的時間難以確定。為避免食物對中藥化學成分的干擾，通常應保持空腹狀態(tài)下灌胃給藥。常規(guī)的做法是在實驗前禁食8～12 h（不禁水），給藥后2 h恢復自由采食。另外給藥間隔及持續(xù)時間的選擇既要貼合臨床給藥實際又要確保含藥血清的藥效。傳統(tǒng)中藥復方服用通法為“一劑藥煎煮兩次后合并藥液，分兩次服用”，制定每日1次的給藥方案勢必直接影響到該藥的療效，因而中藥血清藥理學實驗多采用1 d內(nèi)多次給藥為主［11］。關于給藥的持續(xù)時間目前文獻報道的連續(xù)給藥天數(shù)有3 d者［12］，也有 7 d 者［13］。還有學者提出每隔 1 個半衰期給藥1次，連續(xù)給藥7～10 d。無論設計什么樣的給藥方案，其目的都是為確保有效成分在血清中達到穩(wěn)態(tài)的血藥濃度。由于中藥及其復方成分極其復雜，成分不同，半衰期亦不同，因而中藥復方整體的半衰期很難測定。目前化學成分在體內(nèi)消除半衰期多為1～10 h，且按消除半衰期為給藥間隔給藥，經(jīng)5～6個半衰期后可達藥物的穩(wěn)態(tài)血藥濃度。因此為了確保中藥及其復方絕大多數(shù)成分在含藥血清中濃度維持在一個基本穩(wěn)定的水平，7～10 d給藥方案是比較保險的給藥方法。

2.4 采血時間 藥物血藥濃度會對實驗的結果產(chǎn)生直接的影響。由于中藥及復方經(jīng)給藥后，通過吸收、代謝等一系列生理過程，其血藥濃度的達峰時間會因各種因素而不同，為了避免因血藥濃度低而導致的“假陰性”結果，因此應盡量選擇在血藥濃度達峰時間段內(nèi)采血。但是由于藥物特別是中藥復方的藥代學各不同，其有效成分吸收后血藥達峰濃度的時間也存在差異［14］。因此許多學者對此有不同的看法。有學者認為將采血時間設定為給藥后2 h較為合理，因為大多數(shù)藥物的血藥成分在給藥后1～2 h即可達峰。也有學者研究含藥血清抗血小板作用，以5-HT的釋放和內(nèi)皮細胞鈣通道阻滯作用作為檢測指標，通過對藥物時效關系的觀察，探討含藥物血清制備的最佳采血時間。結果提示對于該藥物，在給藥后30 min時采血，其血清藥理作用最佳［15］。 陳一江等［11］通過對大鼠中藥復方灌胃給藥，每日2次，給藥1 d，分別于末次給藥后0.5 h、1 h、1.5 h、2 h后經(jīng)腹主動脈采血并分離含藥血清，結果表明溫心湯藥物血清能明顯提高離體蛙心的心率和肌張力，且其藥物作用與所取含藥血清的時間相關，其中以末次給藥后1 h的含藥血清藥效最佳。單味中藥乃至復方，因藥物組成復雜，含有多種活性成分，且藥物配伍具有一定的協(xié)同或消減作用，其藥物療效并非簡單的相加，而是多種藥物成分藥理學特性的“綜合效應”，因此很難對其具體作用機制予以闡述。因此，對于單味中藥、藥對、乃至復方的研究，都應進行必要的血清藥理學預實驗，最終確定最合理的采血時間和方案。

2.5 含藥血清的處理和保存 由于血清中存在許多活性成分，如各種溶酶、補體等，而這些成分都會對體外培養(yǎng)的細胞、病毒以及組織器官等產(chǎn)生影響等，因此為避免上述因素的干擾，常采用血清滅活等方法進行處理。常用處理方法［16］有丙酮法、乙醇法、加溫法等。也有學者認為血清中的補體等活性成分可能參與中藥復方各組分的協(xié)同作用等過程，尤其是一些特殊中藥，如抗病毒類、助消化類的中藥，一旦滅活活性成分，其藥理作用可能發(fā)生改變，甚至出現(xiàn)“假陰性”結果。且從正常藥物吸收、代謝過程角度，對血清進行高溫等滅活處理也與藥物入血、起效等過程不符，因此有學者認為不可簡單地一概采用滅活的方法。韓儉等［17］通過實驗研究滅活處理對含藥血清的影響，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過滅活處理后的含藥血清，對研究的幾種細菌均無抑制作用，而未滅活處理的含藥血清可顯著抑制或滅殺流感嗜血桿菌、大腸桿菌。而低溫冷凍真空抽干也因過程中補體作用的活性成分的丟失或失活而出現(xiàn)陰性結果。所以對于血清的處理和保存，應盡可能使用新鮮或保存時間短的滅活血清。

2.6 血清添加量 為了驗證藥物的藥效學及機制等研究，含藥血清的濃度和添加量等至關重要。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著對體外細胞、器官等體系中逐漸增加含藥物血清的添加量，其藥效-含藥血清添加比例曲線呈一定的正態(tài)分布趨勢，這說明反應體系中含藥血清的添加量對藥物的藥效學有一定的影響，但這種作用并非越大越好。高濃度可能因其強細胞毒性作用而影響結果。有學者報道較高濃度的含藥血清在體系中可不同程度抑制細胞增殖，而10%的添加比例應用于實驗中最佳［18］。 王霖等［19］通過實驗研究含藥血清的添加量與藥理毒理作用時發(fā)現(xiàn)，當含藥血清被10倍稀釋時，含藥血清對細胞毒性的幾乎無影響。然而因各類實驗條件的不同，最好的方法是通過預實驗驗證的最佳血清添加比例。

綜上所述，隨著血清藥理學在各個領域的廣泛應用，越來越多的學者通過各種方法對某些研究條件進行完善和改進，以期更好的服務于科學研究。有學者指出血漿和血清兩個概念本身即存在明顯的差別，含藥血漿中的藥效成分含量高于含藥血清［20］，建議體外藥理實驗用含藥血漿代替含藥血清［21］。對中藥特別是中藥復方的研究，血清藥理學將是一把利器，可更好的闡述中醫(yī)藥的療效與機制，使之為現(xiàn)代醫(yī)學領域所認可，實現(xiàn)中醫(yī)藥的國際化。

3 中藥血清藥物化學概念、方法及應用

中藥血清藥物化學是對中藥藥效物質(zhì)基礎進行研究的新領域，在中藥現(xiàn)代化研究中起到重要作用。血清藥物化學是以給藥后的血清為研究對象，從血清中分離并鑒定出移行成分，對血清中移行成分與藥物療效進行相關性分析［22］。通過該實驗方法，可直觀反映中藥給藥后吸收入血的成分數(shù)和量隨采血時間的變化規(guī)律；另外，采用血清色譜指紋圖譜為指導，可選擇性去除血清固有的內(nèi)源性雜質(zhì)，富集吸收入血的有效成分。因此血清藥物化學可以很好地彌補血清藥理學無法確定最佳給藥方案、最佳采血時間、血清固有成分干擾試驗結果等缺陷，可推動中藥藥理及藥代動力學的發(fā)展，實現(xiàn)中藥研究與國際標準的精準接軌。

中藥血清藥物化學是以中藥及復方藥物成分基礎為研究目的的。這也決定其研究范疇應囊括以下幾方面［1］：1）對給藥樣品建立指紋圖譜，明確給藥樣品所含原型成分、含量，并對樣品質(zhì)量穩(wěn)定性精確控制；2）通過在線檢測，確定采血時間及方式；3）采用科學方法對含藥血清的樣品進行制備；4）聯(lián)合高效液相色譜法、液-質(zhì)聯(lián)用法等現(xiàn)代分析手段對血清樣品進行分析和鑒定；5）采用色譜技術、膜分離技術對血中可變成分進行單一化處理；6）對血中相關成分與中藥固有的藥效進行相關性分析，明確藥效的成分；7）對中藥復方進行研究，闡明復方的藥動學特征，指導最佳給藥方案。

血清藥物化學在中藥及其復方研究中得到了廣泛的應用。如單味藥中，從遠志水提物的血清中的移行成分分離獲得了3，4，5-三甲基肉桂酸及其代謝產(chǎn)物甲基3，4，5-三甲基氧基肉桂酸，藥效研究示兩者具有顯著鎮(zhèn)靜催眠作用；越桔莖葉提取物口服給藥后血清中含熊果苷及秦皮苷，藥效研究顯示兩者活性與越桔療效具有相關性；白術提取物入血清檢測未發(fā)現(xiàn)無蒼術酮及蒼術內(nèi)酯，而僅有TEDYA水解產(chǎn)物TEDY吸收入血，提示其直接作用物質(zhì)為TEDY，TEDYA為前藥；東北紅豆杉醇提物入血成分含紫杉醇、紫杉寧、銀杏雙黃酮等成分，且藥效實驗證實其為藥效部位群；口服刺五加提取物后，異秦皮啶的藥時曲線呈現(xiàn)雙峰吸收，但異秦皮啶單體給藥則顯示單峰吸收，該現(xiàn)象可能為提取物所含游離異秦皮啶及其多種前體化合物在體內(nèi)生物轉化共同作用的結果，刺五加提取物相當于異秦皮啶的緩釋系統(tǒng)［23］。在復方研究中，茵陳蒿湯全方口服后吸收入血的21種移行成分中，8種成分為各單味藥或任意組合給藥后入血移行成分所不含，經(jīng)追蹤發(fā)現(xiàn)該8種成分具有顯著的保肝利膽活性［24-25］；六味地黃丸血清藥物化學研究發(fā)現(xiàn)鑒定的11種血清移行成分中，5-羥甲基-2-糠酸含量較高，但體外含量甚微，其出現(xiàn)是藥物與人體以及藥物之間相互協(xié)同作用的結果［26-27］。

綜上所述，血清藥物化學在中藥質(zhì)量標準的建立、復方藥效物質(zhì)基礎等方面具有重要意義。

4 血清藥理學與血清藥物化學的有機結合

以往中藥成分的研究多停留在系統(tǒng)分離的層面上，未能對藥物體內(nèi)吸收、代謝過程中的化學成分進行分析。中藥多以口服給藥并經(jīng)胃腸道、肝腸循環(huán)過程中多種酶、微生物的代謝作用而進入血液，從而發(fā)揮一定的治療作用，即中藥原藥成分并非僅僅通過直接作用而發(fā)揮療效，而可能通過中藥原藥成分、原藥成分代謝產(chǎn)物以及機體隨之產(chǎn)生的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)多靶點、多途徑的整合作用而產(chǎn)生綜合效應（見圖1）。近年來，指紋圖譜控制中藥及其制劑的質(zhì)量逐漸為國內(nèi)外提倡和接受，但是中藥指紋圖譜只能反應中藥及制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性，卻不能直觀反應其療效。采用數(shù)據(jù)處理技術將指紋圖譜中色譜峰峰面積積分數(shù)據(jù)和藥理學數(shù)據(jù)進行關聯(lián)，探討化學成分和藥效學的相關性，即從譜-效關系結合角度研究其生物效應機理，應能更客觀地反映中藥復方的藥效物質(zhì)基礎及配伍規(guī)律。竇志華等在國內(nèi)較早地采用了“血清藥理學”與“血清藥物化學”相結合的模式，通過含藥血清譜-效關系分析這一方法初步闡明了復方制劑五仁醇膠囊保肝作用的藥效物質(zhì)基礎［28］，此后又利用譜效關系研究思路對茵陳蒿湯不同配伍方法下的含藥血清分別進行血清指紋圖譜研究以及保肝作用評價，并分別采用雙變量相關性分析、多元回歸分析，指認血清指紋圖譜中與藥效相關的色譜峰［29］；經(jīng)過篩選得到柴胡-黃芩保肝作用有效部位后，將該有效部位給藥后取不同采血時間的含藥血清進行體外保肝活性研究，同時建立血清指紋圖譜，通過雙變量分析得到譜效相關性結果，最終顯示兩個峰與保肝作用密切相關［30］。因此，隨著對血清指紋圖譜及其血清藥理活性的譜效關系的深入研究，對于中藥或復方療效物質(zhì)基礎研究也將進一步得到闡明。

圖1 血清藥理學及血清藥物化學示意圖［31-32］

傳統(tǒng)的中藥譜效關系研究是指將指紋圖譜與藥理藥效相結合，建立兩者的數(shù)學模型，從相關性結果中發(fā)現(xiàn)能夠反映藥材及制劑質(zhì)量的指標。而含藥血清中的化學成分（中藥原藥成分、原藥成分代謝產(chǎn)物、生理活性物質(zhì)）與藥理活性直接相關，因此將血清藥物化學、血清藥理學兩者結合能更直接反應物質(zhì)基礎與功效、作用之間的關系，能克服中藥及復方粗制劑本身對實驗結果的干擾，并提高藥理實驗重復性、真實性和可靠性。盡管血清藥物化學和血清藥理學仍有許多盲區(qū)，但卻有著重要的應用作用，隨著研究的深入，學科的交叉互補，相信血清藥物化學與血清藥理學協(xié)同研究及其譜效關系研究的會不斷深入和完善，以期更多地應用于中藥及復方的藥理和機制研究中，為中藥譜效關系研究提供更為準確地評價方法。

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