解毒化瘀湯對活動期潰瘍性結(jié)腸炎Th17/Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子的影響*

李丹丹 袁星星 楊 磊 王炳予 劉長發(fā) 張雅麗

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院南崗分院，黑龍江 哈爾濱 150001）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚的以侵犯結(jié)腸和直腸的黏膜及黏膜下層為主要特征的非特異性炎癥，病變呈連續(xù)性、彌漫性分布，多從直腸開始，逐漸累及全結(jié)腸甚至回腸末端，其臨床表現(xiàn)為持續(xù)或者反復(fù)發(fā)作的腹痛腹瀉、黏液樣膿血便、里急后重和不同程度的周身癥狀［1-2］。越來越多研究發(fā)現(xiàn)［3］，多種細(xì)胞因子參與腸道黏膜的炎癥免疫反應(yīng)在UC發(fā)病及其轉(zhuǎn)歸過程中具有重要的作用，而T淋巴細(xì)胞作為人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，尤其是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的輔助性T細(xì)胞17（Th17）和介導(dǎo)免疫耐受的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）細(xì)胞平衡與UC密切相關(guān)。解毒化瘀湯為本文通信作者名中醫(yī)張雅麗教授的經(jīng)驗(yàn)方，已被本科用來治療濕熱蘊(yùn)結(jié)型活動期UC患者，不僅療效顯著，而且無明顯的不良反應(yīng)。為了傳承及繼承其學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)，本研究通過探討解毒化瘀湯對濕熱蘊(yùn)結(jié)型活動期UC患者Th17/Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的影響，進(jìn)一步明確其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2012 年·廣州）》［4］中活動期 UC 相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療共識意見》［5］中濕熱蘊(yùn)結(jié)證。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合活動期UC西醫(yī)和濕熱蘊(yùn)結(jié)證中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡20～65歲；簽署臨床倫理研究知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：緩解期、爆發(fā)性潰瘍性結(jié)腸炎者；3個(gè)月內(nèi)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、水楊酸制劑、止瀉藥等UC治療者；克羅恩病、放射性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎或腸結(jié)核者；伴嚴(yán)重并發(fā)癥或胃、十二指腸潰瘍、肝功能異常、消化系惡性腫瘤者；伴有呼吸、循環(huán)、泌尿、內(nèi)分泌、神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重疾??；既往有水楊酸制劑過敏史者；妊娠期、準(zhǔn)備妊娠及哺乳期婦女。剔除標(biāo)準(zhǔn)：患者依從性差，自行加藥或停藥者；資料不全影響療效，影響安全性者。脫落標(biāo)準(zhǔn)：患者在臨床試驗(yàn)中因各種原因不愿意繼續(xù)者；發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥，不宜繼續(xù)參加本試驗(yàn)者。

1.2 臨床資料 選取2016年9月至2017年1月于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院南崗分院消化科門診及住院處就診的UC患者48例，按照就診先后順序編號，分配選取的隨機(jī)數(shù)字，再對隨機(jī)數(shù)字進(jìn)行處理，分為對照組和治療組各24例。兩組患者性別、年齡、病程、發(fā)病類型、程度及發(fā)病部位等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.3 治療方法 對照組給予美沙拉嗪腸溶片 （葵花藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H19980148，規(guī)格：每片0.25 g）口服，每次1 g，每日4次。治療組在對照組基礎(chǔ)上給予解毒化瘀湯：白頭翁25 g，黃連20 g，黃芩15 g，黃柏 10 g，半枝蓮 15 g，馬齒莧 10 g，丹參 15 g，血竭 15 g，赤芍 15 g，三七 5 g，白芍 10 g，木香 10 g。由本院中藥制劑室統(tǒng)一熬制，每劑煎500 mL，分2袋，早晚飯后溫服。兩組療程均為12周，療程結(jié)束后隨訪12周。

1.4 觀察項(xiàng)目 1）細(xì)胞因子檢測。分別于治療前、后收集兩組患者清晨空腹靜脈血，室溫環(huán)境凝固30 min后以2500 r/min離心10 min，上清液于-20℃保存。采用ELISA法檢測白細(xì)胞介素-17（IL-17）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的濃度，檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書。2）Th17/Treg細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子檢測。分別于治療前、后收集兩組患者外周血并分離其單一核細(xì)胞（PMBC）后進(jìn)行總RNA的提取，并鑒定RNA的純度、濃度及完整性。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成。RT-PCR引物均由大連TaKaRa 有限公司合成（RORγt引物上游：5′-CTGCAA GACTCATCGCCAAAG-3′， 下游：5′-TTTCCACATGCT GGCTACACA-3′；Foxp3 引物上 游：5′-GGGTAGCCA TGGAAACAGCA-3′， 下游：5′-TC GCATGTTGTGGAA CTTGAAGTAG-3′；內(nèi)參 β-actin 引物上游：5′-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3′， 下游：5′-ATGCTATCA CCTCCCCTGTGTG-3′）。采用ABI 7500 PCR儀對合成的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到每個(gè)PCR反應(yīng)管不同指標(biāo)的Ct值后，采用2-△△CT法計(jì)算各個(gè)指標(biāo)經(jīng)內(nèi)參β-actin標(biāo)化后的相對濃度。

1.5 療效標(biāo)準(zhǔn) 參照《潰瘍性結(jié)腸炎中西醫(yī)結(jié)合診療指南（草案）》中療效標(biāo)準(zhǔn)［6］。完全緩解：臨床癥狀消失，腸鏡顯示黏膜病變基本消失或主要癥狀及腸黏膜病變活動指數(shù)總分值降低≥95%。顯效：臨床主要癥狀明顯緩解，腸鏡顯示黏膜病變明顯減輕或主要癥狀及腸黏膜病變活動指數(shù)總分值降低≥70%。有效：臨床主要癥狀有所緩解，腸鏡示黏膜病變有所減輕或主要癥狀及腸黏膜病變活動指數(shù)總分值降低≥30%。無效：經(jīng)治療后臨床癥狀、內(nèi)鏡及病理檢查結(jié)果均無改善或加重，或主要癥狀及腸黏膜病變活動指數(shù)總分值降低＜30%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床療效比較 見表2。療程結(jié)束后，治療組總有效率91.67%，對照組為75.00%，兩組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 兩組臨床療效比較（n）

2.2 兩組治療前后細(xì)胞因子水平比較 見表3。兩組治療后IL-17較治療前均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），治療后治療組明顯優(yōu)于對照組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；兩組治療后IL-10、TGF-β較治療前均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），治療后治療組明顯優(yōu)于對照組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 兩組治療前后細(xì)胞因子水平比較（pg/mL，±s）

表3 兩組治療前后細(xì)胞因子水平比較（pg/mL，±s）

與本組治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組治療后比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別 時(shí) 間 TGF-β IL-17 IL-10治療組 治療前 35.98±11.09（n＝24） 治療后 62.22±13.05**△△對照組 治療前 32.31±12.14 474.52±34.26 157.39±36.15 215.17±23.57**△△ 286.17±44.21**△△457.97±36.28 167.52±34.59（n＝24） 治療后 45.15±10.07**318.13±26.77** 213.54±32.96**

2.3 兩組治療前后RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對表達(dá)量比較 見表4。兩組治療后RORγt mRNA較治療前均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），治療后組間比較，差異明顯（P＜0.01）；兩組治療后Foxp3mRNA較治療前均明顯升高（P＜0.01），治療后組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；兩組治療后RORγt/Foxp3比值較治療前均明顯降低 （P＜0.01），治療后組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 兩組治療前后RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比較（±s）

表4 兩組治療前后RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比較（±s）

組 別 時(shí) 間 RORγt/Foxp3 RORγt mRNA Foxp3 mRNA治療組 治療前 6.58±1.09（n＝24） 治療后 1.28±0.05**△對照組 治療前 5.91±1.14 9.15±1.26 1.39±0.45 4.07±1.07**△△ 3.17±1.21**△8.97±1.31 1.52±0.59（n＝24） 治療后 2.02±0.37**5.13±1.15** 2.54±1.06**

2.4 不良反應(yīng) 兩組治療過程中均無病例退出、失訪，且無明顯不良反應(yīng)事件發(fā)生。對照組隨訪復(fù)發(fā)6例，復(fù)發(fā)率33.33%，治療組隨訪復(fù)發(fā)3例，復(fù)發(fā)率13.64%，兩組復(fù)發(fā)率組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

UC是由遺傳、環(huán)境、免疫等多因素參與的炎癥性疾病，促炎因子的增多和抗炎因子的相對減少是引起腸黏膜免疫反應(yīng)異常和慢性炎癥的主要原因。Th17細(xì)胞因能夠分泌IL-17而命名，是一種新發(fā)現(xiàn)的輔助性淋巴細(xì)胞亞群，除此之外，Th17還能夠分泌IL-6、IL-23及TNF-α等多種炎性細(xì)胞因子，在UC的發(fā)病及腸道黏膜的修復(fù)過程中起著重要的作用［7］。IL-17一方面通過誘導(dǎo)IL-6、GM-CSF和CAM-1等基因的表達(dá)從而增強(qiáng)TNF-α、IL-1誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，另一方面還能通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放促炎因子，對UC的炎癥反應(yīng)起著重要的作用［8］。 研究表明［9-10］，活動期 UC 血清 IL-17明顯高于緩解期UC及正常對照組，且IL-17還可以在一定程度上評價(jià)患者的病情程度及短期治療后的黏膜愈合能力。Treg細(xì)胞不同于其他CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)，是一類具有炎癥抑制作用的CD4+細(xì)胞亞群，其一方面通過分泌大量TGF-β、IL-10等抗炎因子來抑制巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和Th細(xì)胞等促炎性細(xì)胞因子的釋放，另一方面通過負(fù)性調(diào)控抑制Th17細(xì)胞的生成和IL-17的分泌，從而抑制炎癥產(chǎn)生及擴(kuò)大，從而調(diào)控炎癥反應(yīng)及維持人體腸道的免疫耐受［11］。實(shí)驗(yàn)研究表明［12］，Treg細(xì)胞通過增加TGF-β和IL-10的分泌抑制腸道的炎癥反應(yīng)，可以顯著改善UC模型小鼠的腹瀉癥狀。當(dāng)腸上皮出現(xiàn)障礙時(shí)，通過刺激樹突狀細(xì)胞的成熟和分泌IL-6從而上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)，誘導(dǎo)IL-23R的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)Th17的分化及產(chǎn)生IL-17，誘導(dǎo)腸道的炎癥反應(yīng)；當(dāng)IL-6水平降低時(shí)，TGF-β通過上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)Treg細(xì)胞的形成，抑制過度的炎癥反應(yīng)［13］。因此Th17與Treg的平衡在UC的發(fā)病過程中起著重要的作用，同時(shí)RORγt與Foxp3也成為恢復(fù)Th17與Treg之間的平衡與UC疾病恢復(fù)的新免疫靶點(diǎn)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎屬于“泄瀉”“腸癖”等范疇，本病多因飲食不節(jié)或不潔，嗜食辛辣刺激之物，導(dǎo)致濕濁蘊(yùn)結(jié)脾胃，困阻中焦，瘀而化熱，濕熱下注大腸，阻滯氣機(jī)以致血瘀，故濕熱、血瘀交雜貫穿本病全過程，濕熱交雜纏綿不愈，反復(fù)發(fā)作，病程較長。以清熱解毒、活血化瘀為治則的解毒化瘀湯，臨床療效確切能夠明顯改善UC患者的臨床癥狀。其中白頭翁性苦、寒，歸胃、大腸經(jīng)，清熱解毒、涼血止痢，既能清胃腸治濕熱，又能清血分治熱毒。黃連性苦、寒，歸心、大腸經(jīng)，清熱燥濕、瀉火解毒，兩藥共為君藥，發(fā)揮清熱解毒止痢功效?，F(xiàn)代研究表明，白頭翁湯不僅可以顯著抑制痢疾桿菌，還能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，具有良好的抗炎止痢作用［14］。黃芩苦、寒，清熱燥濕，瀉火解毒，止血；黃柏苦、寒，清熱燥濕、瀉火解毒。實(shí)驗(yàn)研究表明［15］，黃芩提取物能夠顯著抑制NOS，從而減少NO的釋放，調(diào)節(jié)AA的代謝，抑制PGE2和LT的合成，發(fā)揮抗炎作用。半枝蓮清熱解毒、化瘀利尿，馬齒莧清熱解毒、涼血止血，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，馬齒莧能改善UC大鼠的一般狀態(tài)，顯著減輕結(jié)腸組織的病損程度，使得病變范圍減小，黏膜缺損變淺，中性粒細(xì)胞浸潤減少，促進(jìn)潰瘍愈合，對UC炎癥急性期具有一定療效［16］。丹參活血祛瘀止痛，赤芍清熱涼血、散瘀止痛，血竭活血化瘀、去腐生肌，研究表明，血竭能夠既可以擴(kuò)張血管，改善腸道黏膜的血液循環(huán)，抑制血栓的形成，同時(shí)又能夠清除氧自由基，降低炎癥發(fā)生，達(dá)到抗炎止痛及抗腫瘤的作用［17］。三七消炎散腫、化瘀止血、化腐生機(jī)，此8藥共為臣藥，瘀祛則濕熱之邪易除。白芍養(yǎng)血堅(jiān)陰、柔肝止痛，木香行氣理氣，健脾消滯，共為佐使。有實(shí)驗(yàn)研究表明，白芍總苷能夠明顯減輕UC模式組織學(xué)的損傷，其作用機(jī)制可能是通過減少TNF-α的表達(dá)，抑制NF-κB的活化來實(shí)現(xiàn)的［18］。綜上全方，共奏清熱解毒利濕，行氣化瘀止痛之功。

本研究發(fā)現(xiàn)治療組總有效率為91.67%，兩組治療后IL-17較治療前均明顯降低（P＜0.01），兩組治療后IL-10、TGF-β較治療前均明顯升高，組間比較，治療組明顯優(yōu)于對照組。兩組治療后RORγt mRNA、RORγt/Foxp3比值較治療前均明顯降低，F(xiàn)oxp3 mRNA較治療前均明顯升高，組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上所述，解毒化瘀湯能夠明顯改善濕熱蘊(yùn)結(jié)型活動期UC炎患者臨床癥狀，減少復(fù)發(fā)率，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的表達(dá)，降低IL-17水平，升高IL-10、TGF-β水平，從而促進(jìn)Th17與Treg之間的平衡實(shí)現(xiàn)的。

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