抗支糖漿對肺炎支原體感染大鼠IL-4、IFN-γ表達的影響*

曲婉瑩 劉志偉 劉璐佳 王 歡 景偉超 王有鵬△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150001）

肺炎支原體是兒童和青少年原發(fā)性非典型肺炎的常見病原菌［1-2］。研究顯示，近年來肺炎支原體肺炎發(fā)病率逐年增高，且難治性肺炎支原體肺炎也有增多趨勢［3］。目前，肺炎支原體感染的致病機制尚不十分明確，認為與直接侵入、細胞損傷以及免疫功能紊亂等機制密切相關［4］。本實驗通過觀察肺炎支原體感染大鼠血清中干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素-4（IL-4）的表達趨勢，探討免疫功能紊亂在肺炎支原體肺炎發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠95只，雄性，體質量（200±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物合格證批號：SCXK（黑）2015003。飼養(yǎng)于室溫（20±2）℃，濕度 40%～50%，SPF級實驗室。

1.2 試藥與儀器 抗支糖漿（黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院制劑室生產，生產批號：黑藥制字Z20131020，規(guī)格：每瓶裝 250 mL）；阿奇霉素（輝瑞制藥有限公司，生產批號：N37482，規(guī)格：0.1 g×6 袋）；大鼠IL-4、IFN-γ ELISA試劑盒 （南京建成生物科技有限公司）。研究型顯微鏡（OLYMPUS日本，儀器型號BX60）；電子天平（上海市梅特勒-托利多有限公司，儀器型號FA1104）；HH-S恒濕水浴鍋（江蘇金壇醫(yī)療儀器廠，儀器型號HH-S11.8）；-80℃超低溫冰箱（德國Eppendorf公司，儀器型號Premium U570）；高速臺式離心機（上海醫(yī)用分析儀器廠，儀器型號TGL16G）；超純水系統(tǒng)（香港Heal Force公司，儀器型號NW10LVF）

1.3 分組與造模 實驗動物適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為空白對照組、模型對照組、抗支糖漿組、阿奇霉素組。除空白對照組20只外，其余每組25只。模型制備采用10%水合氯醛腹腔麻醉，除空白對照組外，其余各組給予106CCU/mL的肺炎支原體菌液100 μL，緩慢滴入大鼠鼻腔，隨呼吸自然進入肺部，空白對照組給予等量生理鹽水滴鼻，共連續(xù) 4 d［5］。

1.4 給藥方法 各組在肺炎支原體最后1次接種后1 d開始給予藥物干預，抗支糖漿組每日予抗支糖漿0.54 mL/100 g灌胃，阿奇霉素組予阿奇霉素（首次給藥量為每天4.5 mg/100 g，第2至5日為每日2.25 mg/100 g）灌胃給藥，空白對照組和模型對照組灌胃等量生理鹽水。

1.5 標本采集及檢測 于給藥后第1、3、5、8、10日采集標本，每個時間點各組分別取5只大鼠，空白對照組取4只，麻醉后腹主動脈取血，3000 r/min離心15 min，取離心后的血清保存于-80℃的環(huán)境中，作為待測樣品用于檢測IFN-γ、IL-4。取頸部、前胸正中皮膚切口，暴露氣管及肺臟，分離氣管，結扎右主支氣管，于左側主支氣管進行氣管插管，進行支氣管肺泡灌洗。用針管抽取2.5 mL預熱的37℃生理鹽水，緩慢注入后保留20 s，然后回抽，同樣操作重復5次。將每只大鼠收集的支氣管肺泡灌洗液以1500 r/min離心10 min，取離心后的上清液保存于-80℃的環(huán)境中，作為待測樣品［6］。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示。凡符合正態(tài)分布和方差齊性的數據，采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD法，凡不符合正態(tài)分布和方差齊性的數據，采用非參數秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠BALF中肺炎支原體PCR檢測結果 于給藥后第1日，除空白對照組外，模型對照組、抗支糖漿組、阿奇霉素組的大鼠支氣管肺泡灌洗液中肺炎支原體-PCR檢測均為陽性，證明各組大鼠成功感染了肺炎支原體。

2.2 各組大鼠血清中IFN-γ、IL-4表達水平比較 見表1。空白對照組、抗支糖漿組、阿奇霉素組分別與模型對照組比較，各時間點IFN-γ表達顯著增高 （P＜0.05）、IL-4 表達顯著降低（P＜0.05）；抗支糖漿組各時間點與阿奇霉素組各時間點間無顯著性差異 （P＞0.05）。除空白組外，其余各組在第3日時，IL-4表達顯著高于其他時間點（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清中 IFN-γ、IL-4及 IFN-γ/IL-4比較（±s）

表1 各組大鼠血清中 IFN-γ、IL-4及 IFN-γ/IL-4比較（±s）

與空白對照組同時期比較，*P＜0.05；與模型對照組同時期比較，△P＜0.05。

組 別 時間 IFN-γ/IL-4空白對照組 1 d 1.40±0.13（n=4） 3 d 1.27±0.14 5 d 1.35±0.12 196.00±13.76 99.40±6.53 10 d 195.22±17.42 99.53±5.18 1.49±0.11模型對照組 1 d 167.79±15.14*131.39±10.21*1.94±0.24（n=5） 3 d 112.58±18.17*172.27±11.57*1.99±0.25 5 d 117.66±15.55*166.61±11.28*1.99±0.25 8 d 124.97±13.96*166.86±10.86*1.98±0.19 10 d 157.49±10.58*158.31±9.33* 1.97±0.23抗支糖漿組 1 d 174.40±13.94△121.47±7.06△ 1.28±0.15*（n=5） 3 d 168.84±14.45△ 133.46±8.42△ 0.65±0.92*5 d 169.21±12.08△ 123.76±8.84△ 0.71±0.12*8 d 171.53±15.90△ 122.48±10.16△ 0.75±0.11*10 d 184.54±9.37△ 120.94±12.75△ 1.00±0.06*阿奇霉素組 1 d 171.94±11.50△ 123.55±4.75△ 1.44±0.15△（n=5） 3 d 166.50±14.00△ 132.14±6.62△ 1.27±0.11△5 d 168.29±9.24△ 125.12±6.95△ 1.37±0.12△8 d 168.47±10.93△ 124.70±10.47△ 1.41±0.17△10 d 181.50±13.14△ 122.03±6.66△ 1.54±0.18△IFN-γ（ng/L） IL-4（ng/L）195.11±15.96 101.51±8.28 198.35±15.92 100.49±6.17 198.09±15.06 99.97±7.11 8 d 1.36±0.16

2.3 各組大鼠血清中IFN-γ/IL-4比較 見表1。與模型對照組比較，IFN-γ/IL-4比值顯著降低 （P＜0.05）；抗支糖漿組各時間點與阿奇霉素組各時間點間無顯著差異（P＞0.05）。

3 討 論

小兒肺炎支原體肺炎，多發(fā)于秋冬季，發(fā)病有區(qū)域流行的現(xiàn)象［7-8］。治療上，鑒于小兒生理特點，臨床較少應用四環(huán)素和喹諾酮類藥物［9］，因此大環(huán)內酯類抗生素已成為小兒支原體肺炎一線藥物。研究顯示，阿奇霉素除具有確切抗菌活性外，還有一定免疫調節(jié)作用，可通過降低炎癥細胞因子和吞噬細胞氧化產物濃度，對氣道產生直接保護作用。該藥療效較好，且安全性高［10-11］。但需注意的是大環(huán)內酯類抗生素耐藥問題也已凸顯。鑒于此，合理用藥是治療小兒支原體肺炎的關鍵所在，中藥在治療本病上有其獨特的優(yōu)勢，中西醫(yī)結合治療亦將逐步成為新的治療趨勢。

抗支糖漿是以王有鵬教授為首的課題組，總結多年臨床經驗，科學配伍而成的有效方劑。該方由蜜麻黃、射干、石膏、苦杏仁、蜜百部、桑白皮、川貝母、黃芩、魚腥草、拳參、蘆根、僵蠶、地龍等組成，配伍精當，制方嚴謹。方中蜜麻黃為君藥，取其宣肺泄熱之功；配伍善祛痰利咽，開痰結之射干，取其辛開苦降、宣降肺氣之功，使痰祛氣順而咳止；配伍辛甘大寒之石膏，相制為用，使其宣肺而不助熱，清肺而不留邪，肺氣肅降有權，咳乃平，二者共為臣藥?？嘈尤省⒚郯俨?、桑白皮、川貝母化痰止咳；黃芩、魚腥草、拳參等清熱解毒；蘆根清熱生津；僵蠶、地龍開肺活血通絡，共為佐藥。全方配伍嚴謹，以宣肺清熱為主，輔以化痰止咳，平喘通絡，使肺熱邪毒得以祛除，諸癥得以改善，是為標本兼治之方，臨床應用效如桴鼓［11-12］。

本次實驗選取的指標IFN-γ、IL-4分別作為Th1及Th2類細胞的代表性細胞因子，二者的表達異?；虮戎诞惓?，在一定程度上反映了機體細胞免疫功能的紊亂［13-14］。且IL-4增高和Th1/Th2比值降低對判斷肺炎支原體感染病情輕重有著十分重要的意義，當病情越重時，IL-4增高越明顯，Th1/Th2比值降低亦越明顯。同時，當IL-4增高時，機體可通過B淋巴細胞分泌IgE，而IFN-γ對IgE的合成有一定抑制作用，所以當IL-4增高和Th1/Th2比值降低時，機體IgE增高，可引發(fā)氣道高反應，誘發(fā)哮喘發(fā)作。從本次實驗的結果看，在本實驗周期內，肺炎支原體肺炎大鼠IFN-γ表達顯著下降，IL-4表達顯著升高，Th1/Th2表達失衡，在第3日時表現(xiàn)尤為顯著，治療上抗支糖漿和阿奇霉素均能促進肺炎支原體大鼠IFN-γ的表達，同時抑制IL-4的表達，且在糾正以上免疫指標失衡方面療效相當，提示抗支糖漿、阿奇霉素均可調節(jié)IFN-γ、IL-4的表達，從而調節(jié)Th1/Th2失衡，以改善MPP感染大鼠免疫功能紊亂的狀態(tài)，進而在一定程度上能減輕氣道高反應，防止其演變?yōu)橄?5］。

大量文獻報道，肺炎支原體肺炎其臨床癥狀輕重不一，肺外并發(fā)癥較常見，極易引起多器官、系統(tǒng)受損［8］。除上文提到的哮喘外，在MP感染肺外并發(fā)癥中，常見的并發(fā)癥為消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和皮膚黏膜等多臟器的損害。由于消化系統(tǒng)與呼吸系統(tǒng)的發(fā)病率最高［16］，因此，本病的研究應更加深入，本課題組將基于抗支糖漿對MP感染模型大鼠免疫應答的調控，進一步探討抗支糖漿對MP感染模型大鼠肺外組織是否有影響。

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