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    補(bǔ)腎益髓方及其拆方對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)瘢痕中GFAP與CSPGs表達(dá)的影響*

    2018-02-05 06:44:06何佳鑫張秋霞李君玲樊永平
    中國(guó)中醫(yī)急癥 2018年1期
    關(guān)鍵詞:血清

    何佳鑫 趙 暉 張秋霞 齊 放 李君玲 張 楠 樊永平 李 明△ 王 蕾△

    (1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,北京 100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院,北京 100050)

    多發(fā)性硬化(MS)是一種以炎癥反應(yīng)、軸突及神經(jīng)元的損傷為主要病理特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)脫髓鞘疾?。?],易反復(fù)發(fā)作,且致殘率較高。軸突修復(fù)和再生是改善該病病情及恢復(fù)患者神經(jīng)功能的治療要點(diǎn)之一[2]。中樞神經(jīng)損傷后會(huì)立即啟動(dòng)一系列和形成瘢痕組織相關(guān)的細(xì)胞及分子間的反應(yīng)。膠質(zhì)瘢痕中生成大量的神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子,破壞神經(jīng)再生微環(huán)境,是導(dǎo)致軸突再生修復(fù)困難的重要原因[3]。硫酸軟骨素糖蛋白(CSPGs)是神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞外基質(zhì)成分中的一類蛋白多糖,由星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)元分泌,在損傷區(qū)堆積,是瘢痕組織中影響神經(jīng)再生的最主要的抑制因子[4]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是膠質(zhì)瘢痕的主要組成部分,膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)為星形膠質(zhì)細(xì)胞的中間絲骨架蛋白,GFAP增強(qiáng)可提示星形膠質(zhì)細(xì)胞活化或反應(yīng)性膠質(zhì)增生,是膠質(zhì)瘢痕的重要標(biāo)志物[5]。目前西醫(yī)主要采用免疫抑制和調(diào)節(jié)的方法治療,對(duì)MS有一定的療效,但長(zhǎng)期大量應(yīng)用副作用大[6],對(duì)神經(jīng)再生無(wú)安全有效的方法。樊永平教授通過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐,根據(jù)MS腎虛兼痰瘀的基本病機(jī),在補(bǔ)腎化痰活血治法的指導(dǎo)下,創(chuàng)立了補(bǔ)腎益髓方[7]。大量臨床研究表明本方能夠改善MS患者神經(jīng)癥狀,減少其復(fù)發(fā),提高了患者生存質(zhì)量[8]。筆者的前期研究顯示補(bǔ)腎益髓方能夠緩解實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠的癥狀,改善其神經(jīng)功能評(píng)分,促進(jìn)受損后神經(jīng)的再生與修復(fù)[9]。在此基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞,利用劃痕法建立膠質(zhì)瘢痕模型,觀察補(bǔ)腎益髓方及其拆方補(bǔ)腎方和化痰活血方含藥血清對(duì)機(jī)械損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及GFAP和CSPGs表達(dá)的影響?,F(xiàn)報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量180~220 g,以及新生24 h的SD乳鼠,均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2016-0011。

    1.2 試藥與儀器 補(bǔ)腎益髓方由生地黃、熟地黃、制首烏、浙貝母、水蛭、全蝎,益母草等組成;補(bǔ)腎方組方藥物主要有生地黃、熟地黃等;化痰活血方主要藥物有浙貝母、水蛭、全蝎等,以上各藥方由北京亞東生物制藥有限公司制備成浸膏粉。DMEM-F12培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司);青霉素及鏈霉素、胰蛋白酶及胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);多聚賴氨酸 (貨號(hào)P1399,美國(guó)Sigma公司)。CCK-8試劑盒由日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所提供;雞抗GFAP多克隆抗體(貨號(hào)ab4674)及Alexa Fluor647標(biāo)記的山羊抗雞IgY-H&L(貨號(hào)ab150171)均由美國(guó)abcam公司提供;小鼠抗CSPGs單克隆抗體 (貨號(hào)C8035)由美國(guó)Sigma公司提供;FITC488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(貨號(hào)ZF-0312)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;DAPI(Southern Biotechg,貨號(hào)0100-20)。CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司);激光共聚焦顯微鏡(LEICA TCSSP5);高內(nèi)涵分析儀(Thermo 公司,型號(hào)ARRAY SCANxTI)

    1.3 造模與分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,將SD大鼠隨機(jī)分為4組各10只,空白血清組(等量蒸餾水),補(bǔ)腎益髓方組(13.48 g生藥/kg),補(bǔ)腎方組(6.36 g生藥/kg),化痰活血方組(7.04 g生藥/kg)。用蒸餾水將各組浸膏粉溶解,連續(xù)7 d灌胃,每日灌胃2次,間隔12 h。末次給藥后2 h,10%水合氯醛麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血,4℃靜置4 h,離心吸取血清并將同組血清混勻,用0.22 μm濾器過(guò)濾除菌,放置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法 1)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的提取、純化。取新生24 h內(nèi)的SD乳鼠大腦皮層并剪碎成小塊,用0.125%胰蛋白酶消化5 min,以40 μm篩過(guò)濾消化液,1000 r/min離心5 min,重懸細(xì)胞并將細(xì)胞種到經(jīng)多聚賴氨酸包被過(guò)的T25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)。待形成單層細(xì)胞層,置于恒溫?fù)u床180 r/min搖2 h后,調(diào)轉(zhuǎn)速260 r/min震搖18 h,去除小膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞。換液后繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%左右,用0.125%胰酶消化傳代,傳代后星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)免疫熒光鑒定純度達(dá)95%以上可用于實(shí)驗(yàn)。2)細(xì)胞分組及給藥方法。細(xì)胞分為正常對(duì)照(NC)組,模型(MO)組,2.5%補(bǔ)腎益髓方組,5%補(bǔ)腎益髓方組,10%補(bǔ)腎益髓方組,每組各設(shè)3個(gè)平行孔,取傳代后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的星形膠質(zhì)細(xì)胞種于96孔板內(nèi),培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后,用10 μL槍頭呈“十”字劃傷細(xì)胞層,盡量保持劃痕大小和范圍一致。NC組與MO組用空白血清處理,其余各組用不同濃度補(bǔ)腎益髓方含藥血清處理,繼續(xù)培養(yǎng)24 h測(cè)定星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率。篩選出合適的補(bǔ)腎益髓方的濃度后,再將細(xì)胞分為NC組,MO組,5%補(bǔ)腎益髓方組,5%補(bǔ)腎方組,5%化痰活血方組,造模及用藥方法同上,測(cè)定星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率及GFAP、CSPGs的表達(dá)。

    1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑法(CCK-8)測(cè)定細(xì)胞存活率。將星形膠質(zhì)細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于96孔板中,每孔100 μL,待細(xì)胞貼壁后,經(jīng)劃痕處理,對(duì)照組與用藥組細(xì)胞均繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,混勻,培養(yǎng)箱中孵育1 h。酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的光密度值(OD值)。計(jì)算細(xì)胞存活率:(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(正常組OD值-空白組OD值)。2)高內(nèi)涵法測(cè)定補(bǔ)腎益髓方及拆方含藥血清對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP及CSPGs表達(dá)的影響。將細(xì)胞密度調(diào)整至8.5×105/mL,按100 μL/孔接種于96孔板中,細(xì)胞貼壁后,劃痕并給予含藥血清處理24 h后,0.01 mol/L PBS沖洗3遍,4%多聚甲醛室溫固定30 min,沖洗。0.3%Triton X-100破膜處理5 min,沖洗。3%BSA/PBS封閉30 min后,加入GFAP(1∶1000)及 CSPGs(1∶200)抗體 4℃孵育 18 h,沖洗。加入Alexa Fluor標(biāo)記山羊抗雞IgY-H&L抗體(紅色,1∶500)及FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(綠色,1∶200)室溫避光孵育 1 h,清洗。用 DAPI室溫染核5 min,清洗。 最后以 100 μL/孔加入 0.01 mol/L PBS,應(yīng)用Cellomics ArrayScan XTI高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)對(duì)GFAP及CSPGs蛋白進(jìn)行測(cè)定和分析。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以(±s)表示,采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 不同濃度補(bǔ)腎益髓含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響 見表1。模型(MO)組細(xì)胞存活率與正常對(duì)照(NC)組相比顯著降低(P<0.01),2.5%,5%,10%補(bǔ)腎益髓含藥血清組細(xì)胞存活率與MO組相比均有不同程度升高 (P<0.05或 P<0.01),而5%、10%補(bǔ)腎益髓含藥血清組優(yōu)于2.5%補(bǔ)腎益髓組 (P<0.05),5%補(bǔ)腎益髓方組細(xì)胞的存活率還高于10%補(bǔ)腎益髓方組,故選取5%補(bǔ)腎益髓方含藥血清作為下一步實(shí)驗(yàn)用藥濃度。

    表1 不同濃度補(bǔ)腎益髓方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響(%,±s)

    表1 不同濃度補(bǔ)腎益髓方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響(%,±s)

    與 NC 組比較, **P<0.01; 與 MO 組比較,#P<0.05,##P<0.01;與2.5%補(bǔ)腎益髓方組比較,△P<0.05。下同。

    組 別 n NC組 3 MO組 3 2.5%補(bǔ)腎益髓方組 3細(xì)胞存活率100.00±7.49 60.77±4.22**69.19±3.37#5%補(bǔ)腎益髓方組 3 78.98±3.89##△10%補(bǔ)腎益髓方組 3 77.51±1.44##△

    2.2 補(bǔ)腎益髓方及其拆方補(bǔ)腎方和化痰活血方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞存活率的影響 見表2。MO組細(xì)胞存活率較NC組顯著降低(P<0.01)。各治療組即全方及拆方含藥血清組細(xì)胞存活率與MO組相比,均有不同程度的上升(P<0.01)。其中補(bǔ)腎益髓方組及補(bǔ)腎方組細(xì)胞存活率優(yōu)于化痰活血方組 (P<0.05或 P<0.01)。

    表2 補(bǔ)腎益髓方及拆方補(bǔ)腎方和化痰活血方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞存活率的影響(%,±s)

    表2 補(bǔ)腎益髓方及拆方補(bǔ)腎方和化痰活血方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞存活率的影響(%,±s)

    組 別 n NC組 3 MO組 3補(bǔ)腎益髓方組 3細(xì)胞存活率100.00±1.28 64.17±1.98**85.18±3.28##△△補(bǔ)腎方組 3 81.50±1.14##△化痰活血方組 3 74.89±4.55##

    2.3 補(bǔ)腎益髓方及其拆方補(bǔ)腎方和化痰活血方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP與CSPGs的影響見表3,圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果NC組免疫熒光染色顯示,GFAP均勻地分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞骨架。與NC組相比,MO組GFAP的平均光密度值較NC組顯著性增高(P<0.01),且劃痕兩側(cè)GFAP熒光染色較非劃痕區(qū)增強(qiáng),可見反應(yīng)性增生后聚集生長(zhǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞,胞體增大,突起增粗、延長(zhǎng)并向劃痕中央?yún)^(qū)伸出。提示星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)劃痕后活化明顯。各用藥組與MO組相比,GFAP的平均光密度值有所降低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NC組CSPGs的免疫熒光染色僅有少量表達(dá),MO組CSPGs熒光染色表達(dá)增強(qiáng)呈強(qiáng)陽(yáng)性,且主要集中在劃痕兩側(cè)。MO組CSPGs的平均光密度值較NC組顯著性地增高(P<0.01),各用藥組CSPGs的平均光密度值與MO組相比,均有所下調(diào) (P<0.05或P<0.01),其中補(bǔ)腎益髓方組CSPGs的平均光密度值與化痰活血方組比較,下降較為顯著(P<0.05)。

    表3 補(bǔ)腎益髓方及拆方補(bǔ)腎方和化痰活血方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP及CSPGs表達(dá)的影響(±s)

    表3 補(bǔ)腎益髓方及拆方補(bǔ)腎方和化痰活血方含藥血清對(duì)劃傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP及CSPGs表達(dá)的影響(±s)

    組 別 n NC組 3 MO組 3補(bǔ)腎益髓方組 3補(bǔ)腎方組 3化痰活血方組 3 GFAP平均熒光密度值 CSPGs平均熒光密度值40.65±0.35 119.07±5.45 45.27±0.76** 154.68±4.48**44.30±0.59 134.52±6.03##44.68±0.10 142.68±2.76##44.89±0.92 143.31±2.95#△

    圖1 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP及CSPGs的表達(dá)變化(400倍)

    3 討 論

    GFAP對(duì)于維持星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及其功能發(fā)揮方面有著重要作用。CNS受損后,損傷區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生,GFAP表達(dá)量增多,不斷堆積成為膠質(zhì)瘢痕的主要組成部分[10-11]。相關(guān)研究表明,抑制GFAP的表達(dá),減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生能夠減少膠質(zhì)瘢痕的寬度和密度,拮抗其對(duì)軸突再生的阻礙作用[12]。劃痕法為機(jī)械損傷屬于離斷模型的一種,能夠模擬星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后的機(jī)理反應(yīng),是常用的細(xì)胞損傷模型之一,用于模擬中樞神經(jīng)受損后的研究[5]。此次實(shí)驗(yàn)中星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)劃痕后形態(tài)改變,劃痕兩側(cè)呈聚集生長(zhǎng),GFAP、CSPGs兩種標(biāo)志性蛋白均顯著性地升高,表明膠質(zhì)瘢痕模型制作成功。補(bǔ)腎益髓方及其拆方對(duì)劃痕損傷后升高的GFAP的調(diào)控作用不明顯,表明補(bǔ)腎益髓方對(duì)膠質(zhì)瘢痕中星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后活化及增生無(wú)明顯作用。

    無(wú)論在動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)或體外實(shí)驗(yàn)中均表明CSPGs在受損區(qū)域積聚呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài),表現(xiàn)出了對(duì)軸突生長(zhǎng)的抑制性[13-14]。CSPGs可與許多神經(jīng)元表面受體結(jié)合,包括NgR1,NgR3,白細(xì)胞共同抗原相關(guān)蛋白(LAR),及其同系物 RPTP[15],并通過(guò)激活 RhoA/ROCK信號(hào)通路,引起生長(zhǎng)錐塌陷,抑制軸突的生長(zhǎng)[16]。本團(tuán)隊(duì)此前實(shí)驗(yàn)研究表明,補(bǔ)腎益髓方及其拆方均能夠不同程度地下調(diào)EAE小鼠腦及脊髓部位CSPGs的表達(dá)且能夠減輕腦及脊髓部位軸突的損傷[9]。此次實(shí)驗(yàn)亦從體外方面證明了補(bǔ)腎益髓方及其拆方能夠抑制CSPGs的表達(dá),尤以補(bǔ)腎益髓方效果為佳,與前期整體研究結(jié)果一致。

    樊永平教授認(rèn)為中醫(yī)藥治療多發(fā)性硬化有明顯的優(yōu)勢(shì),主要適用于緩解期,以促進(jìn)髓鞘的修復(fù)為主。他認(rèn)為多發(fā)性硬化主要病機(jī)為五臟失衡,腎虛髓空[17]。補(bǔ)腎益髓方重在補(bǔ)腎以扶正,佐以化痰活血袪邪。方中生地黃清熱涼血養(yǎng)陰,熟地黃、何首烏填精益髓;浙貝母、天麻清熱化痰熄風(fēng);益母草、水蛭、全蝎活血祛瘀通絡(luò),大黃、連翹清熱解毒散結(jié)。此次研究中補(bǔ)腎益髓方及其拆方均能促進(jìn)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活性,而補(bǔ)腎益髓方與補(bǔ)腎方優(yōu)于化痰活血方,可能與補(bǔ)腎益髓方以補(bǔ)腎藥物為主而補(bǔ)腎方藥對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有顯著地保護(hù)作用與修復(fù)作用有關(guān)[18]。補(bǔ)腎方與化痰活血方雖均可下調(diào)劃痕后的CSPGs,而補(bǔ)腎益髓方全方干預(yù)抑制因子CSPGs表達(dá)的效果優(yōu)于拆方補(bǔ)腎方與化痰活血方,說(shuō)明通過(guò)補(bǔ)腎藥物與化痰活血藥物配伍協(xié)同發(fā)揮作用更有助于促進(jìn)軸突的再生與修復(fù)。

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