補腎益髓方及其拆方對星形膠質(zhì)細胞膠質(zhì)瘢痕中GFAP與CSPGs表達的影響*

何佳鑫 趙 暉 張秋霞 齊 放 李君玲 張 楠 樊永平 李 明△ 王 蕾△

（1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100050）

多發(fā)性硬化（MS）是一種以炎癥反應(yīng)、軸突及神經(jīng)元的損傷為主要病理特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）脫髓鞘疾病［1］，易反復(fù)發(fā)作，且致殘率較高。軸突修復(fù)和再生是改善該病病情及恢復(fù)患者神經(jīng)功能的治療要點之一［2］。中樞神經(jīng)損傷后會立即啟動一系列和形成瘢痕組織相關(guān)的細胞及分子間的反應(yīng)。膠質(zhì)瘢痕中生成大量的神經(jīng)生長抑制因子，破壞神經(jīng)再生微環(huán)境，是導(dǎo)致軸突再生修復(fù)困難的重要原因［3］。硫酸軟骨素糖蛋白（CSPGs）是神經(jīng)系統(tǒng)細胞外基質(zhì)成分中的一類蛋白多糖，由星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞神經(jīng)元分泌，在損傷區(qū)堆積，是瘢痕組織中影響神經(jīng)再生的最主要的抑制因子［4］。星形膠質(zhì)細胞是膠質(zhì)瘢痕的主要組成部分，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）為星形膠質(zhì)細胞的中間絲骨架蛋白，GFAP增強可提示星形膠質(zhì)細胞活化或反應(yīng)性膠質(zhì)增生，是膠質(zhì)瘢痕的重要標志物［5］。目前西醫(yī)主要采用免疫抑制和調(diào)節(jié)的方法治療，對MS有一定的療效，但長期大量應(yīng)用副作用大［6］，對神經(jīng)再生無安全有效的方法。樊永平教授通過長期臨床實踐，根據(jù)MS腎虛兼痰瘀的基本病機，在補腎化痰活血治法的指導(dǎo)下，創(chuàng)立了補腎益髓方［7］。大量臨床研究表明本方能夠改善MS患者神經(jīng)癥狀，減少其復(fù)發(fā)，提高了患者生存質(zhì)量［8］。筆者的前期研究顯示補腎益髓方能夠緩解實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠的癥狀，改善其神經(jīng)功能評分，促進受損后神經(jīng)的再生與修復(fù)［9］。在此基礎(chǔ)上，本實驗通過體外培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞，利用劃痕法建立膠質(zhì)瘢痕模型，觀察補腎益髓方及其拆方補腎方和化痰活血方含藥血清對機械損傷后星形膠質(zhì)細胞活性及GFAP和CSPGs表達的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，以及新生24 h的SD乳鼠，均由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2016-0011。

1.2 試藥與儀器 補腎益髓方由生地黃、熟地黃、制首烏、浙貝母、水蛭、全蝎，益母草等組成；補腎方組方藥物主要有生地黃、熟地黃等；化痰活血方主要藥物有浙貝母、水蛭、全蝎等，以上各藥方由北京亞東生物制藥有限公司制備成浸膏粉。DMEM-F12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；青霉素及鏈霉素、胰蛋白酶及胎牛血清（美國Gibco公司）；多聚賴氨酸 （貨號P1399，美國Sigma公司）。CCK-8試劑盒由日本株式會社同仁化學(xué)研究所提供；雞抗GFAP多克隆抗體（貨號ab4674）及Alexa Fluor647標記的山羊抗雞IgY-H&L（貨號ab150171）均由美國abcam公司提供；小鼠抗CSPGs單克隆抗體 （貨號C8035）由美國Sigma公司提供；FITC488標記山羊抗小鼠IgG（貨號ZF-0312）北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAPI（Southern Biotechg，貨號0100-20）。CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；酶標儀（美國Molecular Devices公司）；激光共聚焦顯微鏡（LEICA TCSSP5）；高內(nèi)涵分析儀（Thermo 公司，型號ARRAY SCANxTI）

1.3 造模與分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將SD大鼠隨機分為4組各10只，空白血清組（等量蒸餾水），補腎益髓方組（13.48 g生藥/kg），補腎方組（6.36 g生藥/kg），化痰活血方組（7.04 g生藥/kg）。用蒸餾水將各組浸膏粉溶解，連續(xù)7 d灌胃，每日灌胃2次，間隔12 h。末次給藥后2 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，4℃靜置4 h，離心吸取血清并將同組血清混勻，用0.22 μm濾器過濾除菌，放置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實驗方法 1）原代星形膠質(zhì)細胞的提取、純化。取新生24 h內(nèi)的SD乳鼠大腦皮層并剪碎成小塊，用0.125%胰蛋白酶消化5 min，以40 μm篩過濾消化液，1000 r/min離心5 min，重懸細胞并將細胞種到經(jīng)多聚賴氨酸包被過的T25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。待形成單層細胞層，置于恒溫搖床180 r/min搖2 h后，調(diào)轉(zhuǎn)速260 r/min震搖18 h，去除小膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞。換液后繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長滿80%左右，用0.125%胰酶消化傳代，傳代后星形膠質(zhì)細胞經(jīng)免疫熒光鑒定純度達95%以上可用于實驗。2）細胞分組及給藥方法。細胞分為正常對照（NC）組，模型（MO）組，2.5%補腎益髓方組，5%補腎益髓方組，10%補腎益髓方組，每組各設(shè)3個平行孔，取傳代后處于對數(shù)生長期的星形膠質(zhì)細胞種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)細胞貼壁后，用10 μL槍頭呈“十”字劃傷細胞層，盡量保持劃痕大小和范圍一致。NC組與MO組用空白血清處理，其余各組用不同濃度補腎益髓方含藥血清處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h測定星形膠質(zhì)細胞的存活率。篩選出合適的補腎益髓方的濃度后，再將細胞分為NC組，MO組，5%補腎益髓方組，5%補腎方組，5%化痰活血方組，造模及用藥方法同上，測定星形膠質(zhì)細胞存活率及GFAP、CSPGs的表達。

1.5 標本采集與檢測 1）細胞計數(shù)試劑法（CCK-8）測定細胞存活率。將星形膠質(zhì)細胞以1×105/mL的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，待細胞貼壁后，經(jīng)劃痕處理，對照組與用藥組細胞均繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，混勻，培養(yǎng)箱中孵育1 h。酶標儀450 nm波長檢測各孔的光密度值（OD值）。計算細胞存活率：（實驗組OD值-空白組OD值）/（正常組OD值-空白組OD值）。2）高內(nèi)涵法測定補腎益髓方及拆方含藥血清對星形膠質(zhì)細胞GFAP及CSPGs表達的影響。將細胞密度調(diào)整至8.5×105/mL，按100 μL/孔接種于96孔板中，細胞貼壁后，劃痕并給予含藥血清處理24 h后，0.01 mol/L PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛室溫固定30 min，沖洗。0.3%Triton X-100破膜處理5 min，沖洗。3%BSA/PBS封閉30 min后，加入GFAP（1∶1000）及 CSPGs（1∶200）抗體 4℃孵育 18 h，沖洗。加入Alexa Fluor標記山羊抗雞IgY-H&L抗體（紅色，1∶500）及FITC標記的山羊抗小鼠IgG抗體（綠色，1∶200）室溫避光孵育 1 h，清洗。用 DAPI室溫染核5 min，清洗。 最后以 100 μL/孔加入 0.01 mol/L PBS，應(yīng)用Cellomics ArrayScan XTI高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)對GFAP及CSPGs蛋白進行測定和分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度補腎益髓含藥血清對劃傷后星形膠質(zhì)細胞存活率的影響 見表1。模型（MO）組細胞存活率與正常對照（NC）組相比顯著降低（P＜0.01），2.5%，5%，10%補腎益髓含藥血清組細胞存活率與MO組相比均有不同程度升高 （P＜0.05或 P＜0.01），而5%、10%補腎益髓含藥血清組優(yōu)于2.5%補腎益髓組 （P＜0.05），5%補腎益髓方組細胞的存活率還高于10%補腎益髓方組，故選取5%補腎益髓方含藥血清作為下一步實驗用藥濃度。

表1 不同濃度補腎益髓方含藥血清對劃傷后星形膠質(zhì)細胞存活率的影響（%，±s）

表1 不同濃度補腎益髓方含藥血清對劃傷后星形膠質(zhì)細胞存活率的影響（%，±s）

與 NC 組比較， **P＜0.01； 與 MO 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與2.5%補腎益髓方組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n NC組 3 MO組 3 2.5%補腎益髓方組 3細胞存活率100.00±7.49 60.77±4.22**69.19±3.37#5%補腎益髓方組 3 78.98±3.89##△10%補腎益髓方組 3 77.51±1.44##△

2.2 補腎益髓方及其拆方補腎方和化痰活血方含藥血清對劃傷后星形膠質(zhì)細胞細胞存活率的影響 見表2。MO組細胞存活率較NC組顯著降低（P＜0.01）。各治療組即全方及拆方含藥血清組細胞存活率與MO組相比，均有不同程度的上升（P＜0.01）。其中補腎益髓方組及補腎方組細胞存活率優(yōu)于化痰活血方組 （P＜0.05或 P＜0.01）。

表2 補腎益髓方及拆方補腎方和化痰活血方含藥血清對劃傷后星形膠質(zhì)細胞細胞存活率的影響（%，±s）

表2 補腎益髓方及拆方補腎方和化痰活血方含藥血清對劃傷后星形膠質(zhì)細胞細胞存活率的影響（%，±s）

組 別 n NC組 3 MO組 3補腎益髓方組 3細胞存活率100.00±1.28 64.17±1.98**85.18±3.28##△△補腎方組 3 81.50±1.14##△化痰活血方組 3 74.89±4.55##

2.3 補腎益髓方及其拆方補腎方和化痰活血方含藥血清對劃傷后星形膠質(zhì)細胞GFAP與CSPGs的影響見表3，圖1。實驗結(jié)果NC組免疫熒光染色顯示，GFAP均勻地分布在星形膠質(zhì)細胞細胞骨架。與NC組相比，MO組GFAP的平均光密度值較NC組顯著性增高（P＜0.01），且劃痕兩側(cè)GFAP熒光染色較非劃痕區(qū)增強，可見反應(yīng)性增生后聚集生長的星形膠質(zhì)細胞，胞體增大，突起增粗、延長并向劃痕中央?yún)^(qū)伸出。提示星形膠質(zhì)細胞經(jīng)劃痕后活化明顯。各用藥組與MO組相比，GFAP的平均光密度值有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。NC組CSPGs的免疫熒光染色僅有少量表達，MO組CSPGs熒光染色表達增強呈強陽性，且主要集中在劃痕兩側(cè)。MO組CSPGs的平均光密度值較NC組顯著性地增高（P＜0.01），各用藥組CSPGs的平均光密度值與MO組相比，均有所下調(diào) （P＜0.05或P＜0.01），其中補腎益髓方組CSPGs的平均光密度值與化痰活血方組比較，下降較為顯著（P＜0.05）。

表3 補腎益髓方及拆方補腎方和化痰活血方含藥血清對劃傷后星形膠質(zhì)細胞GFAP及CSPGs表達的影響（±s）

表3 補腎益髓方及拆方補腎方和化痰活血方含藥血清對劃傷后星形膠質(zhì)細胞GFAP及CSPGs表達的影響（±s）

組 別 n NC組 3 MO組 3補腎益髓方組 3補腎方組 3化痰活血方組 3 GFAP平均熒光密度值 CSPGs平均熒光密度值40.65±0.35 119.07±5.45 45.27±0.76** 154.68±4.48**44.30±0.59 134.52±6.03##44.68±0.10 142.68±2.76##44.89±0.92 143.31±2.95#△

圖1 各組星形膠質(zhì)細胞GFAP及CSPGs的表達變化（400倍）

3 討 論

GFAP對于維持星形膠質(zhì)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及其功能發(fā)揮方面有著重要作用。CNS受損后，損傷區(qū)的星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生，GFAP表達量增多，不斷堆積成為膠質(zhì)瘢痕的主要組成部分［10-11］。相關(guān)研究表明，抑制GFAP的表達，減少星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)性增生能夠減少膠質(zhì)瘢痕的寬度和密度，拮抗其對軸突再生的阻礙作用［12］。劃痕法為機械損傷屬于離斷模型的一種，能夠模擬星形膠質(zhì)細胞損傷后的機理反應(yīng)，是常用的細胞損傷模型之一，用于模擬中樞神經(jīng)受損后的研究［5］。此次實驗中星形膠質(zhì)細胞經(jīng)劃痕后形態(tài)改變，劃痕兩側(cè)呈聚集生長，GFAP、CSPGs兩種標志性蛋白均顯著性地升高，表明膠質(zhì)瘢痕模型制作成功。補腎益髓方及其拆方對劃痕損傷后升高的GFAP的調(diào)控作用不明顯，表明補腎益髓方對膠質(zhì)瘢痕中星形膠質(zhì)細胞損傷后活化及增生無明顯作用。

無論在動物整體實驗或體外實驗中均表明CSPGs在受損區(qū)域積聚呈現(xiàn)高表達的狀態(tài)，表現(xiàn)出了對軸突生長的抑制性［13-14］。CSPGs可與許多神經(jīng)元表面受體結(jié)合，包括NgR1，NgR3，白細胞共同抗原相關(guān)蛋白（LAR），及其同系物 RPTP［15］，并通過激活 RhoA/ROCK信號通路，引起生長錐塌陷，抑制軸突的生長［16］。本團隊此前實驗研究表明，補腎益髓方及其拆方均能夠不同程度地下調(diào)EAE小鼠腦及脊髓部位CSPGs的表達且能夠減輕腦及脊髓部位軸突的損傷［9］。此次實驗亦從體外方面證明了補腎益髓方及其拆方能夠抑制CSPGs的表達，尤以補腎益髓方效果為佳，與前期整體研究結(jié)果一致。

樊永平教授認為中醫(yī)藥治療多發(fā)性硬化有明顯的優(yōu)勢，主要適用于緩解期，以促進髓鞘的修復(fù)為主。他認為多發(fā)性硬化主要病機為五臟失衡，腎虛髓空［17］。補腎益髓方重在補腎以扶正，佐以化痰活血袪邪。方中生地黃清熱涼血養(yǎng)陰，熟地黃、何首烏填精益髓；浙貝母、天麻清熱化痰熄風(fēng)；益母草、水蛭、全蝎活血祛瘀通絡(luò)，大黃、連翹清熱解毒散結(jié)。此次研究中補腎益髓方及其拆方均能促進損傷后星形膠質(zhì)細胞細胞活性，而補腎益髓方與補腎方優(yōu)于化痰活血方，可能與補腎益髓方以補腎藥物為主而補腎方藥對神經(jīng)細胞有顯著地保護作用與修復(fù)作用有關(guān)［18］。補腎方與化痰活血方雖均可下調(diào)劃痕后的CSPGs，而補腎益髓方全方干預(yù)抑制因子CSPGs表達的效果優(yōu)于拆方補腎方與化痰活血方，說明通過補腎藥物與化痰活血藥物配伍協(xié)同發(fā)揮作用更有助于促進軸突的再生與修復(fù)。

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