蜂膠乙醇提取物對斷奶仔豬腸道菌群及腸道黏膜免疫功能的影響

王 留，方磊涵，王向國

（商丘職業(yè)技術(shù)學院，河南 商丘 476000）

斷奶仔豬由于腸道結(jié)構(gòu)和生理功能發(fā)育不完善，腸道微生物區(qū)系生態(tài)平衡尚未完全建立和腸道黏膜免疫功能尚不健全，致使斷奶仔豬的飼養(yǎng)管理成為養(yǎng)豬生產(chǎn)中最難管理的階段，也是決定養(yǎng)豬生產(chǎn)經(jīng)濟效益的關(guān)鍵階段。在斷奶仔豬飼料或飲水中添加天然提取物，促進仔豬腸道菌群的建立與腸道微生物區(qū)系的生態(tài)平衡，以及促進腸道黏膜免疫功能的提高成為養(yǎng)好斷奶仔豬的有效措施之一。蜂膠是蜜蜂在采集花粉、釀制蜂蜜過程中形成的一種天然產(chǎn)物，具有抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激等多種生物學活性[1-3]。為了研究蜂膠乙醇提取物對斷奶仔豬腸道菌群及腸道黏膜免疫功能的影響，本試驗在飲水中添加不同濃度的蜂膠乙醇提取物，測定斷奶仔豬糞便中乳酸菌、大腸桿菌、雙歧桿菌、沙門氏菌等有益菌與有害菌的數(shù)量和腸道分泌性免疫球蛋白A（sIgA）含量的變化，探索蜂膠乙醇提取物調(diào)節(jié)斷奶仔豬腸道菌群生態(tài)平衡和改善腸道黏膜免疫功能的機制，為蜂膠產(chǎn)品的開發(fā)和在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電子天平，電熱恒熱水浴鍋，恒溫培養(yǎng)箱，臺式冷凍離心機，酶標反應(yīng)板，酶標儀。sIgA雙抗體夾心ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）檢測試劑盒購于上海生工生物工程公司。乳酸菌培養(yǎng)基（MRS）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基（MAC）、沙門菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗材料

蜂膠乙醇提取物，商丘職業(yè)技術(shù)學院藥理實驗室自制，詳見參考文獻[3]。

1.3 試驗動物

30頭28日齡杜長大三元雜交斷奶仔豬隨機平均分成3組，各組均飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧。試驗期間，試驗1和2組斷奶仔豬飲水中分別添加終濃度為1和2 g/L的蜂膠乙醇提取物，自由飲水；空白對照組正常飲水。試驗于2017年6月3—30日在商丘牧原科技有限公司養(yǎng)豬場進行，斷奶仔豬均采用高床飼養(yǎng)，保健與免疫按該場年度保健計劃與免疫程序進行。試驗期28 d。

1.4 樣品采集

分別于仔豬42和56日齡時每組采集20 g新鮮糞樣，分成兩份，分裝于封口袋中，并做好標記。-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ环萦糜跈z測糞樣sIgA，另一份用于檢測腸道菌群。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 腸道菌群培養(yǎng)計數(shù) 在無菌操作臺中，準確稱取1 g均勻混合的糞樣，加入到裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中，充分振蕩混合均勻后作遞增的10倍倍比稀釋至10-7g/mL，吸取相應(yīng)稀釋度的糞便稀釋液0.1 mL滴加于選擇性培養(yǎng)基上，每個稀釋度3個重復(fù)。乳酸菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌分別以MRS培養(yǎng)基、MRS+X-gal培養(yǎng)基、MAC培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù)，計算每克糞樣中的活菌數(shù)（CFU·g-1）。

1.5.2 糞樣中sIgA的測定 在無菌操作臺中，準確稱取1 g均勻混合的糞樣，加入到裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中，充分振蕩混合均勻后3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。采用豬sIgA雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒測定糞便上清液中sIgA，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 試驗數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計處理軟件進行方差分析，P＜0.05判定為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 蜂膠乙醇提取物對斷奶仔豬腸道菌群的影響

試驗結(jié)果表明（表1），1和2 g/L蜂膠乙醇提取物組斷奶仔豬在42日齡和56日齡時腸道內(nèi)的大腸桿菌、沙門氏菌數(shù)量均低于空白對照組，且2 g/L蜂膠乙醇提取物組斷奶仔豬在56日齡時腸道的大腸桿菌、沙門氏菌數(shù)量與空白對照組相比差異顯著（P＜0.05）。1和2 g/L蜂膠乙醇提取物組斷奶仔豬在42日齡和56日齡時腸道內(nèi)的乳酸菌、雙歧桿菌數(shù)量與空白對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 蜂膠乙醇提取物對斷奶仔豬腸道分泌型sIgA的影響

由表1可知，蜂膠乙醇提取物能夠提高斷奶仔豬腸道分泌型sIgA水平。飲水中添加1 g/L的蜂膠乙醇提取物的試驗組斷奶仔豬，在42和56日齡時，腸道分泌型sIgA水平與空白對照組相比有一定程度提高，但是差異不顯著（P＞0.05）。飲水中添加2 g/L的蜂膠乙醇提取物的試驗組斷奶仔豬，在56日齡時，腸道分泌型sIgA水平與空白對照組相比有較大提高，差異顯著（P＜0.05）。

表1 蜂膠乙醇提取物對斷奶仔豬腸道菌群、腸道分泌型sIgA的影響

3 討論與分析

3.1 蜂膠乙醇提取物對斷奶仔豬腸道菌群的影響

腸道菌群是一個復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，腸道菌群與動物的營養(yǎng)吸收、免疫功能、生長發(fā)育、健康狀況等密切相關(guān)，腸道菌群的失衡會導致動物的生理代謝和生理機能發(fā)生障礙，引發(fā)動物腹瀉、免疫功能降低、抗病力差等相關(guān)疾病。動物腸道微生物種類眾多，大腸桿菌、沙門氏菌等細菌是斷奶仔豬腸道菌群中的主要有害菌，而乳酸菌、雙歧桿菌是主要的有益菌。在動物飼料或飲水中添加天然提取物，提高動物腸道中乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌的數(shù)量，抑制或降低大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的數(shù)量，改善動物腸道微生物區(qū)系，建立腸道菌群的動態(tài)平衡，有助于提高動物的生長性能和抗病能力[4-5]。

本試驗在斷奶仔豬飲水中添加不同劑量的蜂膠乙醇提取物，通過測定糞便中菌群的變化以反映蜂膠乙醇提取物對斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系的影響。試驗結(jié)果顯示，蜂膠乙醇提取物能夠抑制試驗組斷奶仔豬腸道中大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的生長，減少糞便中大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的數(shù)量，隨蜂膠乙醇提取物添加濃度和添加時間的增加，對仔豬腸道中大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的抑制作用逐漸顯著，56日齡時飲水中添加2 g/L的蜂膠乙醇提取物的試驗組斷奶仔豬糞便中大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的數(shù)量顯著低于空白對照組。蜂膠乙醇提取物對試驗組斷奶仔豬腸道中乳酸菌、雙歧桿菌有促進作用，但與空白對照組相比差異不顯著。說明蜂膠乙醇提取物能夠降低斷奶仔豬腸道內(nèi)有害菌的數(shù)量和重建仔豬腸道菌群平衡。

3.2 蜂膠乙醇提取物對斷奶仔豬腸道分泌型sIgA的影響

腸道既是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要場所，也是動物體內(nèi)最大的免疫器官，通過腸道黏膜的機械屏障、生物屏障和免疫屏障作用阻斷或清除病原微生物的感染。分泌型sIgA是腸道黏膜免疫的主要免疫效應(yīng)因子，sIgA通過與病原微生物的抗原相結(jié)合清除或殺滅腸腔、腸上皮細胞、黏膜固有層內(nèi)的病原體。左偉勇等[6]在仔豬飼糧中添加2%的低分子量大豆肽能顯著降低仔豬空腸腸道大腸桿菌數(shù)，顯著提高乳酸桿菌數(shù)和空腸黏膜sIgA水平。Lessard等[7]給仔豬飼喂益生菌后，腸黏膜表面slgA的分泌量顯著增加，提高了仔豬腸道黏膜免疫力。張丹等[8]給BALB/c小鼠灌胃嗜酸乳桿菌14 d后，腸黏膜sIgA含量明顯升高，嗜酸乳桿菌定植于腸黏膜并形成生物屏障保護，并提高其免疫功能。在本試驗中，42日齡和56日齡時，飲水中添加1和2 g/L蜂膠乙醇提取物組斷奶仔豬腸道分泌型sIgA水平均高于空白對照組，且2 g/L蜂膠乙醇提取物組斷奶仔豬在56日齡時腸道分泌型sIgA水平顯著高于空白對照組。說明飲水中添加2 g/L蜂膠乙醇提取物能夠顯著提高斷奶仔豬腸道分泌型sIgA的合成與分泌，改善仔豬腸道黏膜免疫功能。

[1]王秉彼，張慧娟.北京蜂膠的化學成分研究 [J].中藥通報，1988，13（10）：37-38.

[2]遲家平，薛秉文，陳海生.遼西蜂膠黃酮類化學成分的研究[J].中國藥學雜志，1996，31（5）：264-266.

[3]王留，方磊涵，王向國.蜂膠乙醇提取物對斷奶仔豬生長性能和抗氧化功能的影響[J].養(yǎng)豬，2017（4）：15-16.

[4]楊田田，于龍魅，劉二強，等.天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對小鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)小腸黏膜免疫功能和腸道菌群的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2014，26（11）：3387-3395.

[5]王留，王向國.大棗多糖對保育豬腸道微生物菌群及腸道組織形態(tài)的影響[J].養(yǎng)豬，2014（6）：7-8.

[6]左偉勇，洪偉鳴，陳高，等.低分子質(zhì)量大豆肽對斷奶仔豬腸道免疫功能的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報，2013，36（5）：108-112.

[7]Lessard M,Dupuis M,Gagnon N,et a1．Administration of Pediococcus acidilactici or Saccharomyces cerevisiae boulardii modulates development of porcine mucosal immunity and reduces intestinal bacterial translocation after Escherichia coli challenge[J]．J Anim Sci,2009,87(3):922-934．

[8]張丹，張丹丹，章金葉，等.嗜酸乳桿菌S-層蛋白對感染大腸桿菌小鼠腸黏膜免疫功能的影響 [J].現(xiàn)代食品科技，2015，31（10）：13-17.