白念珠菌White-Gray-Opaque表型轉(zhuǎn)換系統(tǒng)的研究進(jìn)展

王鈺婷 劉錦燕 趙悅 孟玲寧 項(xiàng)明潔

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院放免檢驗(yàn)科，上海 200020)

白念珠菌是一種條件致病菌，常寄居于健康人體皮膚、口腔、胃腸道、陰道等部位。在人體免疫力低下時(shí)，可轉(zhuǎn)換成致病菌引起表淺感染甚至是危及生命的系統(tǒng)性感染。據(jù)報(bào)道，大約75%的女性一生中至少被確診患過1次陰道念珠菌病，而侵襲性念珠菌病則是引起新生兒重癥監(jiān)護(hù)室內(nèi) (NICU)晚期敗血癥的重要原因之一，其致死率可高達(dá)約30%[1]。白念珠菌的毒力作用是其致病的主要原因，其中表型轉(zhuǎn)換是一大毒力因子，該菌可通過表型轉(zhuǎn)換以更好地適應(yīng)宿主體內(nèi)的環(huán)境變化，進(jìn)而促進(jìn)其定植和感染。

在白念珠菌表型轉(zhuǎn)換系統(tǒng)中，酵母-菌絲相轉(zhuǎn)換和White-Gray-Opaque三態(tài)轉(zhuǎn)換是最具代表性的，而White-Gray-Opaque轉(zhuǎn)換作為一種新型表型系統(tǒng)吸引了越來越多研究者的關(guān)注。早在1987年時(shí)，就有學(xué)者在白念珠菌中發(fā)現(xiàn)White-Opaque轉(zhuǎn)換；直到2014年，Tao等[2]發(fā)現(xiàn)了一種新的細(xì)胞形態(tài)，被稱為gray表型，由此形成了White-Gray-Opaque三穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)。

1 White、Gray、Opaque表型特點(diǎn)

White、Gray、Opaque這三種細(xì)胞表型在細(xì)胞形態(tài)、菌落外觀、交配能力、毒力、基因表達(dá)譜等方面均有區(qū)別[2-4]。通過肉眼觀察不含熒光桃紅B (Phloxine B)平板上的白念珠菌菌落，White細(xì)胞形成光滑的半球形白色菌落；Gray細(xì)胞為灰色、光滑的菌落；Opaque細(xì)胞為灰色、不透明的菌落，這三種細(xì)胞表型也由此命名。在電鏡下，White細(xì)胞小而圓，呈橢球形，大小約4.9～6.8 m；Gray細(xì)胞小而長(zhǎng)，呈梭形，比White細(xì)胞略大，大小約5.9～6.9 m；Opaque細(xì)胞大而長(zhǎng)，形似扁豆，大小約9.5～11.8 m。在交配能力方面，White

此外，Gray細(xì)胞的全基因表達(dá)譜與White細(xì)胞和Opaque細(xì)胞有較大差異，Efg1、Wor1分別在White、Opaque細(xì)胞中特異性高表達(dá)，是誘導(dǎo)和維持相應(yīng)表型的核心調(diào)節(jié)因子。Lip9、Pga26、Hsp31、Hms1等基因是Gray表型的特異性表達(dá)基因，但是維持Gray表型的主要調(diào)節(jié)因子目前還不明。

2 White-Gray-Opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)控

白念珠菌White-Gray-Opaque轉(zhuǎn)換不同于經(jīng)典的酵母-菌絲相的表型轉(zhuǎn)換。菌絲形成需要環(huán)境因素的刺激，如37℃生理溫度、CO2、中性至堿性條件、血清、N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)等，而White-Gray-Opaque轉(zhuǎn)換既可在環(huán)境刺激下發(fā)生，又可自發(fā)發(fā)生，三類細(xì)胞的表型是穩(wěn)定且可遺傳的[5-6]。

2.1 環(huán)境因素影響White-Gray-Opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換

White-Gray-Opaque三穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)受許多外界環(huán)境因素的影響，比如CO2、GlcNAc、溫度和環(huán)境pH。研究發(fā)現(xiàn)，CO2和GlcNAc促進(jìn)White向Opaque細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)換，有利于白念珠菌維持Opaque形態(tài)，但對(duì)于White細(xì)胞向Gray細(xì)胞的轉(zhuǎn)換沒有明顯影響[7-8]。同時(shí)，在GlcNAc作為碳源的培養(yǎng)條件下，較高的溫度 (>27℃)可促進(jìn)細(xì)胞從White向Opaque表型轉(zhuǎn)換，低溫不利于維持Opaque表型[9]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，酸性pH (pH4～6)可促進(jìn)基因型為MTLα/α的菌株向Opaque表型轉(zhuǎn)化，而在MTLa/a的菌株中則未觀察到這種現(xiàn)象[10]。pH作為環(huán)境因子可影響部分菌株的White-Opaque表型轉(zhuǎn)化，但目前未見pH對(duì)Opaque-White轉(zhuǎn)換及Gray表型誘導(dǎo)的報(bào)道。

2.2 交配基因座 (Mating type locus，MTL)

最初發(fā)現(xiàn)White-Opaque表型轉(zhuǎn)換系統(tǒng)時(shí)，研究者認(rèn)為交配基因座 (Mating type locus，MTL)可調(diào)控White-Opaque轉(zhuǎn)換，只有純合型菌株才可進(jìn)行White-Opaque轉(zhuǎn)換[11]，這是因?yàn)镸TLa/α雜合型菌株形成MTLa1/α2復(fù)合體抑制Wor1表達(dá)，降低了白念珠菌向Opaque表型轉(zhuǎn)換的頻率[12]。然而，隨著研究的深入，Xie等[13]在GlcNAc作為碳源和5%CO2的條件下，發(fā)現(xiàn)MTL雜合型菌株也可被誘導(dǎo)生成Opaque表型。這一研究提示，在一定的培養(yǎng)條件下，白念珠菌均可以發(fā)生White-Opaque轉(zhuǎn)換。在此基礎(chǔ)上，Tao等的研究顯示，在MTL缺陷株 (MTLa/Δ和MTLΔ/α)中，白念珠菌仍能表達(dá)White、Gray和Opaque這三種表型，且MTL缺陷株Gray細(xì)胞與其親代MTLa/α株Gray細(xì)胞在形態(tài)上幾乎是一致的[2]。由此可見，MTL純合子在某些培養(yǎng)條件下可以影響表型轉(zhuǎn)換的頻率，但它并不是維持White、Gray和Opaque表型的必要因子。

2.3 分子調(diào)控機(jī)制

在分子調(diào)控層面，目前已知在White-Gray-Opaque表型轉(zhuǎn)換中起重要作用的是Wor1和Efg1[12]。Wor1是維持Opaque表型的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子；wor1Δ/Δ缺陷株細(xì)胞轉(zhuǎn)換為Opaque表型會(huì)受到阻滯。Efg1是維持White表型的必要因子；efg1Δ/Δ缺陷株不能完成向White表型的轉(zhuǎn)換。WOR1和EFG1雙缺失的菌株細(xì)胞保持在Gray表型，任何培養(yǎng)條件下均不能實(shí)現(xiàn)向White或Opaque表型的轉(zhuǎn)換[2]。由此可見，Wor1、Efg1分別對(duì)于White、Opaque表型的形成是必需的，但目前對(duì)于Gray表型形成的重要分子仍未明確。除此之外，Wor2、Wor3和Czf1在Opaque細(xì)胞中的表達(dá)高于White細(xì)胞，利于維持Opaque表型[14]。Wang等發(fā)現(xiàn)，Ahr1作為是一類鋅指蛋白，必須在Efg1存在的條件下才能促進(jìn)細(xì)胞向White表型轉(zhuǎn)換[15]。

2.4 組蛋白乙酰化修飾

蛋白質(zhì)乙?；揎椀墓δ苤饕菍?duì)細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)的影響以及調(diào)控核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的激活。一般認(rèn)為，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶 (Histone Acetyltransferase, HAT)參與組蛋白的乙?；? 促進(jìn)基因活化; 組蛋白去乙?；?(Histone Deacetylase，HDAC)參與組蛋白的去乙?；?，主要使基因沉默[16]。目前的研究成果顯示，在白念珠菌中，組蛋白乙?；揎椩谡{(diào)節(jié)Opaque表型也起著重要作用。

Stevenson等[17]發(fā)現(xiàn)，在白念珠菌中，RTT109 (組蛋白H3K56乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因)和HST3 (組蛋白H3K56去乙酰酶編碼基因)在White-Opaque轉(zhuǎn)換中起著拮抗作用。RTT109位于WOR1上游，通過促進(jìn)組蛋白H3K56的乙?；?，從而上調(diào)Opaque表型。而HST3的作用與RTT109相反，HST3促進(jìn)H3K56的去乙?；抡{(diào)Opaque表型。

此外，Xie等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Rpd3和Rpd31是位于WOR1上游的分子，Rpd31僅比Rpd3有一個(gè)延長(zhǎng)的C末端，但兩者對(duì)WOR1的轉(zhuǎn)錄起著截然不同的作用。Rpd3通過與其他共調(diào)節(jié)因子形成CaRpd3L復(fù)合物降低HDAC活性，乙?；缴?，進(jìn)而促進(jìn)WOR1基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)Opaque表型的表達(dá)。而Rpd31作用相反，通過形成CaRpd31S復(fù)合物抑制WOR1基因轉(zhuǎn)錄，下調(diào)Opaque表型的表達(dá)。

3 White、Gray、Opaque表型與宿主的相互作用

3.1 White、Gray、Opaque表型對(duì)宿主的作用

研究顯示，White、Gray、Opaque表型在宿主感染不同部位起著不同作用。Tao等[19]通過尾靜脈注射感染小鼠，發(fā)現(xiàn)腎臟載菌量White>Opaque>Gray細(xì)胞，與小鼠生存曲線顯示的White細(xì)胞感染小鼠最早死亡的結(jié)果相一致。而在皮膚表淺感染中，用不同表型的白念珠菌感染小鼠舌頭，細(xì)胞繁殖速度Gray>Opaque>White細(xì)胞，且Gray細(xì)胞所造成的皮膚損傷也較另兩種表型嚴(yán)重[2]。臨床研究也顯示，在念珠菌性外陰陰道病患者中分離出的白念珠菌三種表型的毒力為Gray>Opaque>White。

此外，白念珠菌各表型細(xì)胞代謝相關(guān)的基因譜不同，各表型在代謝途徑和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用上存在差異，在人體內(nèi)存在代謝適應(yīng)[5]。通過基因譜分析顯示，White細(xì)胞主要是發(fā)酵代謝，Opaque細(xì)胞是氧化代謝[20]，而Gray細(xì)胞代謝相關(guān)的表達(dá)譜則與前兩者有著較大差異[2]。同時(shí)，在White細(xì)胞中，糖代謝有關(guān)的基因表達(dá)較高，如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因 (HXT3、HXT4、HXT7)、糖酵解酶編碼基因 (HXK1)、磷酸果糖激酶編碼基因 (PFK2)等。在Opaque細(xì)胞中，則高表達(dá)參與三羧酸循環(huán)酶的編碼基因，如異檸檬酸脫氫酶編碼基因 (IDP2)和蘋果酸脫氫酶編碼基因 (MDH1)，而三羧酸循環(huán)是三大營(yíng)養(yǎng)素 (糖類、脂類、氨基酸)的最終代謝通路，提示Opaque細(xì)胞可利用多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[20-21]。在人體血液中含有葡萄糖，而皮膚中則沒有，這可以解釋為什么糖代謝有關(guān)基因高表達(dá)的White細(xì)胞在系統(tǒng)性血流感染中往往具有更高的毒力。

3.2 宿主對(duì)White、Gray、Opaque細(xì)胞的作用

在發(fā)生感染時(shí)，免疫細(xì)胞對(duì)不同表型的細(xì)胞作用不同。Geiger等[22]發(fā)現(xiàn)，White細(xì)胞產(chǎn)生中性粒細(xì)胞趨化因子，而Opaque細(xì)胞不產(chǎn)生這種趨化因子，從而減少中性粒細(xì)胞移行到感染部位，這可能是Opaque細(xì)胞逃避粒細(xì)胞吞噬的一種機(jī)制。在Mallick的研究中，將White細(xì)胞和Opauqe細(xì)胞分別與以下具有吞噬功能的免疫細(xì)胞反應(yīng)：果蠅S2細(xì)胞、小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞、小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞 (BMDM)和人中性粒細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些吞噬細(xì)胞對(duì)White細(xì)胞吞噬率為均高于Opaque細(xì)胞[23]。中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞選擇性地吞噬Opaque細(xì)胞，而研究發(fā)現(xiàn)樹突細(xì)胞可同時(shí)吞噬White和Opaque細(xì)胞[24]。目前，關(guān)于免疫細(xì)胞如何作用于Gray細(xì)胞的研究還未見報(bào)道。

4 結(jié)語與展望

表型轉(zhuǎn)換作為白念珠菌的一種新型毒力因子，表型改變后，其致病力、毒力與宿主免疫作用等均會(huì)發(fā)生改變，各個(gè)表型在宿主適應(yīng)、感染及不同生活階段發(fā)揮著不同作用[5]。目前White-Gray-Opaque表型轉(zhuǎn)換的影響因素有著較為深入的研究，尤其是調(diào)控機(jī)制方面。像乙酰化轉(zhuǎn)錄后修飾機(jī)制也越來越引起研究者的關(guān)注，那么其他轉(zhuǎn)錄后修飾作用如磷酸化、泛素化、甲基化等是否也對(duì)該表型系統(tǒng)有作用？同時(shí)白念珠菌作為與人體共生的真菌，各表型除了與宿主免疫細(xì)胞的相互作用，與人體還有什么其他的關(guān)系？White-Gray-Opaque表型系統(tǒng)仍有許多問題值得研究，白念珠菌形態(tài)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性也比原先認(rèn)為的要復(fù)雜得多，因此，表型的研究有助于解釋病原體是如何適應(yīng)各種環(huán)境的，深入了解形態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制有助于尋找感染治療的新策略。