采用微量液基稀釋法對(duì)伊可爾?抗菌劑體外抗真菌活性探索性研究

萬(wàn)喆 侯晴,2 李若瑜 王愛(ài)平

(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京 100034；2.上海長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，上海 200003)

伊可爾?抗菌劑是一種純中藥復(fù)方外用溶液，按照產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)由苦參、金銀花、大青葉、五倍子等為主要原料精制而成，其中乙醇含量為15%～25%，苦參含量為18 g/L，金銀花含量為16 g/L，大青葉含量為16 g/L，五倍子含量為16 g/L。適用于皮膚抗菌，可殺滅金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白念珠菌。該中藥復(fù)方外用溶液在體外是否具有抗真菌活性？抗真菌活性效果如何？是否能采用國(guó)際上公認(rèn)的美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制訂的M-38 A2 (皮膚癬菌)和M27-A3 (酵母菌)方案進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)？由于伊可爾?抗菌劑是一種復(fù)方中藥外用溶液，含有一定量的乙醇溶液及沉淀物，因此，本研究先采用CLSI M-38 A2 (皮膚癬菌)和M27-A3 (酵母菌)微量液基稀釋法對(duì)皮膚科最常見(jiàn)的紅色毛癬菌及白念珠菌各1株菌進(jìn)行了體外藥物敏感性測(cè)定預(yù)試驗(yàn)，并對(duì)伊可爾?抗菌劑原液含乙醇與除乙醇進(jìn)行比較，過(guò)濾與不過(guò)濾進(jìn)行比較。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，本研究對(duì)皮膚癬菌病中常見(jiàn)的兩種致病菌即紅色毛癬菌和趾間毛癬菌各10株菌進(jìn)行了體外藥敏試驗(yàn)，目的是采用微量液基稀釋法對(duì)中藥復(fù)方溶液體外抗真菌活性進(jìn)行探索性研究。

1 材料與方法

1.1 受試藥物

伊可爾?抗菌劑原液 (乙醇含量為15%～25%)及其除乙醇原液均由北京派特博恩 (天津)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)，許可證號(hào) (津)衛(wèi)消證字 (2017)第01號(hào)。規(guī)格：15 mL/瓶。伊可爾?抗菌劑測(cè)試樣品見(jiàn)表1。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，最終采用了伊可爾?抗菌劑原液過(guò)濾 (乙醇含量為15%～25%)進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)。

表1 伊可爾?抗菌劑的測(cè)試樣品

1.2 受試菌株

預(yù)試驗(yàn)菌株包括紅色毛癬菌 (BMU-08583)1株和白念珠菌 (BMU-05260)1株。之后的受試菌株包括紅色毛癬菌10株，趾間毛癬菌10株，均來(lái)自北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科、北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心分離保藏菌株。

1.3 培養(yǎng)基

按照CLSI方案要求采用RPMI-1640液體培養(yǎng)基。

1.4 菌種培養(yǎng)和鑒定

預(yù)試驗(yàn)菌株和受試菌株均采用表型 (形態(tài)學(xué))、生理生化及分子生物學(xué)的鑒定方法進(jìn)行了鑒定。

1.5 體外藥敏試驗(yàn)方法

紅色毛癬菌和趾間毛癬菌參照CLSI M38-A2微量液基稀釋法進(jìn)行測(cè)定；白念珠菌參照CLSI M27-A3微量液基稀釋法進(jìn)行測(cè)定。

1.6 藥敏板制作

將伊可爾?抗菌劑原液 (四種)1∶1稀釋的藥物作為第1孔濃度由高到低依次倍比稀釋成10個(gè)藥物濃度，即1∶1～1∶512；加入微量藥敏板 (96孔酶標(biāo)板)1～10列中，每孔100 μL，第11、12列分別加入100、200 μL相應(yīng)液體培養(yǎng)基，分別作為生長(zhǎng)對(duì)照和空白對(duì)照，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 菌液制備及接種

將紅色毛癬菌和趾間毛癬菌菌株轉(zhuǎn)種于PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)生長(zhǎng)5～7 d。用無(wú)菌生理鹽水洗脫純化的菌落，制成菌懸液，使用比濁儀調(diào)整菌懸液濃度至 (1～5)×106CFU/mL，再用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋菌液50倍使其菌含量為 (2～10)×104CFU/mL。在96孔板中1～11列每孔加入菌液100 μL，使其最終菌濃度為 (1～5)×104CFU/mL。

將白念珠菌菌株轉(zhuǎn)種于SDA上35℃培養(yǎng)生長(zhǎng)24～72 h，制成菌懸液，使用比濁儀調(diào)整菌懸液濃度至 (1～5)×106CFU/mL，先用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋菌液20倍，再稀釋50倍使其菌含量為 (1～5)×103CFU/mL，在96孔板中1～11列每孔加入菌液100 μL，使其最終菌濃度為 (0.5～2.5)×103CFU/mL。

1.8 培養(yǎng)

紅色毛癬菌和趾間毛癬置于35℃恒溫培養(yǎng)，4～7 d看結(jié)果。白念珠菌置于35℃恒溫培養(yǎng)24～72 h看結(jié)果。

1.9 結(jié)果判定

按照CLSI制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀。只有當(dāng)生長(zhǎng)對(duì)照生長(zhǎng)良好，方認(rèn)為試驗(yàn)成功，可進(jìn)行結(jié)果判讀。由于每次試驗(yàn)均設(shè)置對(duì)照，一般情況下的藥敏試驗(yàn)每株菌進(jìn)行一次檢測(cè)。對(duì)于中藥復(fù)方溶液進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)不足，本研究為確保試驗(yàn)準(zhǔn)確性，每株菌同時(shí)進(jìn)行了二次藥敏試驗(yàn)，按照判斷原則，只要二次測(cè)定結(jié)果在二個(gè)稀釋度范圍內(nèi)，屬于允許誤差，表明兩次測(cè)定一致性好，試驗(yàn)成功。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)紅色毛癬菌和白念珠菌預(yù)試驗(yàn)

伊可爾?抗菌劑含乙醇原液 (過(guò)濾與未過(guò)濾)對(duì)白念珠菌的最小抑菌濃度 (MIC)均為1∶8；對(duì)紅色毛癬菌的MIC分別為1∶64和1∶128。伊可爾?抗菌劑除乙醇原液 (過(guò)濾與未過(guò)濾)對(duì)白念珠菌的MIC均為1∶16；對(duì)紅色毛癬菌的MIC均為1∶128。伊可爾?抗菌劑體外抗真菌活性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2伊可爾?抗菌劑體外抗真菌活性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

Tab.2Preliminary results of antifungal activityinvitrofor yikeer?antimicrobial agent

菌種 (株數(shù))MIC伊可爾?抗菌劑含乙醇(過(guò)濾)伊可爾?抗菌劑除乙醇(過(guò)濾)伊可爾?抗菌劑含乙醇(原液)伊可爾?抗菌劑除乙醇(原液)白念珠菌 (1)1∶81∶161∶81∶16紅色毛癬菌 (1)1∶641∶128 1∶128 1∶128

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果提示伊可爾?抗菌劑具有一定的體外抗真菌活性，尤其對(duì)紅色毛癬菌的作用更明顯，MIC為1∶128 (即對(duì)伊可爾?抗菌劑原液倍比稀釋8倍的結(jié)果)。對(duì)白念珠菌亦有抗菌活性，MIC為1∶8～1∶16 (即對(duì)伊可爾?抗菌劑原液倍比稀釋4～5倍的結(jié)果)。結(jié)果顯示含乙醇和不含乙醇溶液的伊可爾?抗菌劑對(duì)體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果基本無(wú)影響，說(shuō)明乙醇無(wú)抗真菌活性，真正的抗真菌活性來(lái)自于伊可爾?抗菌劑中的中藥成分。結(jié)果顯示過(guò)濾和不過(guò)濾的伊可爾?抗菌劑原液對(duì)體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果亦無(wú)影響，說(shuō)明真正的抗真菌活性亦來(lái)自于伊可爾?抗菌劑原液中的中藥成分，但過(guò)濾后觀察藥敏板的菌落生長(zhǎng)情況更加清晰。

2.2 對(duì)紅色毛癬菌和趾間毛癬菌體外抗真菌活性

伊可爾?抗菌劑體外對(duì)紅色毛癬菌的MIC在1∶64～1∶256；對(duì)趾間毛癬菌的MIC在1∶64～1∶128。每株菌兩次試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果一致性好。伊可爾?抗菌劑對(duì)紅色毛癬菌和趾間毛癬菌體外抗真菌活性見(jiàn)表3。

表3伊可爾?抗菌劑對(duì)紅色毛癬菌和趾間毛癬菌的體外抗真菌活性 (MIC)

Tab.3Antifungal activityinvitrotoT.rubrumandT.interdigitale(MIC) for yikeer?antimicrobial agent

菌種株數(shù)1∶321∶641∶1281∶2561∶512紅色毛癬菌1004420趾間毛癬菌1007300合計(jì)20011720

3 討 論

伊可爾?抗菌劑是一種純中藥復(fù)方外用溶液，系中科院采用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)精制而成。主要成分為鴉膽子、大青葉、苦參、蛇床子等，其中鴉膽子含有多種生物堿類、苦味素及油酸等，其藥理作用是選擇性破壞癌細(xì)胞膜和線粒體等膜性系統(tǒng)，使癌細(xì)胞發(fā)生退行性變或壞死，同時(shí)對(duì)感染的HPV合成復(fù)制具有抑制和清理作用。大青葉、苦參中含有大量的鞣質(zhì)、醇類、皂甙等物質(zhì)，具有強(qiáng)效的抗菌、抗病毒作用，可干擾、阻止HPV的DNA合成，抑制病毒生長(zhǎng)與繁殖，同時(shí)具有清熱解毒、活血散瘀、提高和激活皮膚免疫的作用[1-2]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)中藥單體抗真菌作用有一些相關(guān)報(bào)道，盧詳婷[3]對(duì)10種中藥提取物抗念珠菌體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示三七總皂甙、人參莖葉皂甙、檸檬酸和麝香草酚對(duì)念珠菌具有一定的抗菌活性，不同的中藥提取物針對(duì)念珠菌不同菌種的抗真菌作用存在一定差異。周艷萌等[4]采用結(jié)晶紫和XTT兩種方法均測(cè)出厚樸煎煮液對(duì)白念珠菌黏附具有抑制作用，發(fā)現(xiàn)XTT法能更確切地檢測(cè)厚樸煎煮液對(duì)白念珠菌的黏附抑制作用。但對(duì)于中藥復(fù)方溶液抗真菌作用的研究罕見(jiàn)有報(bào)道。伊可爾?抗菌劑是一種中藥復(fù)方溶液，目前主要用于HPV相關(guān)疾病的治療，取得了良好的療效。本研究顯示伊可爾?抗菌劑對(duì)于紅色毛癬菌和趾間毛癬菌體外具有明顯的抗真菌活性，對(duì)于紅色毛癬菌的MIC在1∶64～1∶256，即對(duì)伊可爾?抗菌劑原液倍比稀釋到7～9倍具有抗真菌作用。對(duì)趾間毛癬菌的MIC在1∶64～1∶128，即對(duì)伊可爾?抗菌劑原液倍比稀釋到7～8倍具有抗真菌作用。初步的研究顯示伊可爾?抗菌劑作為一種中藥復(fù)方溶液在體外具有一定的抗皮膚癬菌活性。采用CLSI M-38 A2微量液基稀釋法對(duì)皮膚癬菌進(jìn)行中藥復(fù)方溶液體外抗真菌菌活性研究是可行的，具有實(shí)驗(yàn)結(jié)果易分析、方便、可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)。本研究?jī)H對(duì)兩個(gè)菌種各10株菌進(jìn)行了探討性體外藥敏試驗(yàn)研究，有待于今后擴(kuò)大樣本數(shù)及擴(kuò)充菌種進(jìn)一步研究，為從中醫(yī)中藥中開(kāi)發(fā)高效低毒的抗真菌藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。