基因編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源上的應(yīng)用

韓紅兵 ，謝卡斌 ，曹罡 ，田見暉 ，王棟

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

一、基因編輯技術(shù)簡介

（一）技術(shù)概念

基因編輯是對(duì)生物基因組的特定位點(diǎn)精準(zhǔn)操作，實(shí)現(xiàn)脫氧核糖核酸（DNA）片段定點(diǎn)刪除、插入或者單個(gè)堿基突變等的一項(xiàng)技術(shù)。技術(shù)包括兩個(gè)過程：一是精準(zhǔn)定位，在基因組上準(zhǔn)確找到特定DNA片段；二是利用工具酶執(zhí)行DNA編輯功能。當(dāng)工具酶使生物體細(xì)胞基因組DNA雙鏈斷裂后，可通過非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)，產(chǎn)生堿基插入或缺失，導(dǎo)致功能基因的失活；還可通過同源重組修復(fù)（HDR），達(dá)到DNA片段插入或堿基突變。以鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）為代表的第二代基因編輯技術(shù)，提高了基因編輯效率。2013年，以CRISPR/Cas9（clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）系統(tǒng)為標(biāo)志的第三代基因編輯技術(shù)取得了決定性突破，并因其操作簡便、成本低、效率高、多靶標(biāo)等特有優(yōu)勢，成功獲得抗藍(lán)耳病豬、無角奶牛，突破了常規(guī)育種瓶頸，成為基因編輯主流技術(shù)。伴隨著基因編輯技術(shù)的不斷改進(jìn)及其在動(dòng)植物上的廣泛應(yīng)用，未來農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)l(fā)生顛覆性變革。

（二）技術(shù)特性

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)特性主要體現(xiàn)在：①操作簡單、成本低。利用Cas9蛋白的切割酶活性、sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白定位目標(biāo)位點(diǎn)的特性，僅構(gòu)建Cas9基因和sgRNA表達(dá)質(zhì)粒，即可完成基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建。②編輯效率高。靶向切割DNA雙鏈效率達(dá)50%以上，最高達(dá)90%以上，介導(dǎo)的同源重組效率也達(dá)到40%以上，遠(yuǎn)高于先前的技術(shù)體系。③靶點(diǎn)覆蓋廣，靶向性高。以PAM（protospacer adjacent motifs）序列（即NGG）為識(shí)別序列，該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)基因組全部基因的編輯（人類基因組每8bp就存在一個(gè)PAM序列）。同時(shí)，sgRNA種子序列（距PAM序列8～12堿基）應(yīng)與靶DNA完全配對(duì)的切割限制，進(jìn)一步增強(qiáng)了靶向性。④同時(shí)編輯的多個(gè)基因。Cas9蛋白能同時(shí)與多個(gè)不同sgRNA形成剪切復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)基因同時(shí)編輯。⑤通用性廣。無基因、細(xì)胞類型及物種限制，特別適用于對(duì)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的動(dòng)物、植物或微生物（病毒、細(xì)菌）的基因組改造。

二、基因編輯技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用現(xiàn)狀

（一）技術(shù)發(fā)展歷程

20世紀(jì)80年代末期，馬里奧·卡佩奇研發(fā)了基因打靶技術(shù)[1]，實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物細(xì)胞基因組的精準(zhǔn)編輯，具有里程碑意義。隨著研究的逐漸深入，推動(dòng)該技術(shù)不斷取得突破，并建立了多種技術(shù)體系。其中，ZFNs技術(shù)是最早的人工內(nèi)切核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)[2]，在玉米、小鼠、人、果蠅、斑馬魚、牛和豬等多種動(dòng)植物中成功應(yīng)用。該技術(shù)編輯效率較高，但系統(tǒng)構(gòu)建難度大、費(fèi)用高，限制其推廣和應(yīng)用。而同期的TALEN技術(shù)作為另一項(xiàng)基因編輯技術(shù)，操作相對(duì)簡單，也可使特定靶DNA序列雙鏈斷裂，實(shí)現(xiàn)精確基因編輯[3]，平均編輯效率達(dá)40%以上，在酵母、果蠅、斑馬魚、爪蟾、小鼠、大鼠、水稻、豬、牛、羊等多種生物上都有應(yīng)用。由第一代基因打靶到第二代ZFN和TALEN基因編輯技術(shù)，編輯效率實(shí)現(xiàn)了質(zhì)的飛躍。2012年，美國科學(xué)家首次證實(shí)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠靶向精確切割DNA片段，并實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物細(xì)胞基因組精準(zhǔn)編輯[4～6]，標(biāo)志著基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)的新突破。此后，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)逐漸應(yīng)用于動(dòng)植物、微生物等領(lǐng)域，成為高效、簡便、通用的主流基因編輯技術(shù)。并通過突變型Cas9與胞嘧啶脫氨酶、尿嘧啶糖苷酶抑制蛋白及腺苷脫氨酶結(jié)合，發(fā)展了單堿基基因編輯技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)堿基轉(zhuǎn)換[7,8]。

（二）基因編輯技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域

1. 突破了動(dòng)物遺傳改良與新品種培育瓶頸

傳統(tǒng)動(dòng)物育種周期長，優(yōu)良性狀聚合難度大，改良目標(biāo)性狀不確定性大?；蚓庉嫾夹g(shù)不僅突破了傳統(tǒng)育種難以解決的遺傳障礙，而且能實(shí)現(xiàn)特定性狀的精準(zhǔn)改變，顛覆了已有動(dòng)物遺傳改良技術(shù)路徑和選育效率。世界各發(fā)達(dá)國家和新興經(jīng)濟(jì)體已將基因編輯技術(shù)作為優(yōu)先發(fā)展方向超前部署，以期搶占未來動(dòng)物育種制高點(diǎn)。

（1）生產(chǎn)性能改良

育種專家們發(fā)現(xiàn)，肌肉生成抑制素（MSTN）是一種肌肉生長負(fù)調(diào)控因子，該基因自然突變的比利時(shí)藍(lán)牛和皮埃蒙特牛肌肉量豐富，比其他肉牛肉量多18%～20%。因此，針對(duì)動(dòng)物育種中產(chǎn)肉性狀改良進(jìn)展緩慢問題，通過基因編輯技術(shù)，創(chuàng)制了MSTN基因功能缺失的豬、牛、羊，顯著提高了肌肉生長速度和廋肉率[9～11]，并使其表現(xiàn)出了經(jīng)典的“雙肌臀”特征。另外，有角表型不利于飼養(yǎng)管理，而常規(guī)育種培育無角牛至少需要20年以上，并可能導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降。為此，美國科學(xué)家基于對(duì)角型控制基因的研究成果，對(duì)荷斯坦奶?；蚪M的角型等位基因進(jìn)行編輯，將其替換成無角基因Pc，培育了無角奶牛[12]，減少了動(dòng)物爭斗，提高了產(chǎn)奶性能。此外，對(duì)FGF5基因編輯，同樣也提高了羊毛產(chǎn)量，增加了羊毛細(xì)度。

（2）產(chǎn)品品質(zhì)改善

β-乳球蛋白是牛奶、羊奶中的固有蛋白成分，是引起嬰兒過敏的重要過敏原之一（嬰兒的消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，β-乳球蛋白較容易“整顆”被吸收，而被免疫系統(tǒng)判斷為病原），傳統(tǒng)選育無法去掉該過敏原成分。2011年，我國首次通過基因編輯技術(shù)，敲除了奶牛β-乳球蛋白基因，創(chuàng)制了奶中不含β-乳球蛋白的奶牛，可以生產(chǎn)適合嬰兒食用的奶制品[13]，進(jìn)一步改善了乳品質(zhì)。該研究為奶山羊育種新材料創(chuàng)制指明了方向，通過對(duì)羊乳過敏原β-乳球蛋白基因進(jìn)行編輯，使對(duì)奶制品過敏的人群也可以盡情享受奶制品。

（3）抗病性能提升

動(dòng)物重大傳染性疾病不僅威脅人類健康，也給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，這一直是育種專家和疫病專家無法解決、無法逾越的產(chǎn)業(yè)難題，基因編輯技術(shù)為該難題的解決提供了重要思路。以動(dòng)物傳染性海綿狀腦病為例，該病是一種由朊病毒蛋白（PRNP）基因引起的牛、羊和人共患中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。我國學(xué)者利用基因編輯技術(shù)敲除了PRNP基因，獲得了抗瘋牛病牛和抗羊瘙癢病綿羊與山羊等育種新材料[14～16]。同樣，通過基因編輯將抗結(jié)核病的小鼠基因Ipr1導(dǎo)入奶?；蚪M，培育了抗結(jié)核病奶牛[17]。采用基因編輯技術(shù)，美國科學(xué)家使豬藍(lán)耳?。≒RRS）病毒結(jié)合受體CD163基因功能缺失，獲得CD163基因編輯豬，該豬對(duì)PRRS具有完全抗性，化解了頭號(hào)烈性傳染病對(duì)豬養(yǎng)殖業(yè)的威脅[18,19]。

2. 突破提高農(nóng)作物產(chǎn)量、品質(zhì)改良及抗病抗逆性選育瓶頸

（1）增產(chǎn)和品質(zhì)改善

產(chǎn)量性狀是微效多基因性狀，傳統(tǒng)遺傳選育遺傳進(jìn)展已趨緩慢，然而，利用基因編輯技術(shù)分別敲除水稻產(chǎn)量負(fù)調(diào)控基因Gn1a、DEP1、GS3和IPA1，水稻每穗實(shí)粒數(shù)或粒密度、粒長都明顯增加，稻米產(chǎn)量大幅提高[20～22]。同樣，利用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)編輯小麥粒長和粒重負(fù)調(diào)控基因TaGASR7，也使小麥粒重顯著增加。直鏈淀粉含量影響水稻品質(zhì)，采用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向修飾直鏈淀粉合成酶基因OsWaxy，突變水稻直鏈淀粉含量由14.6%下降至2.6% [23]，改善了稻米糯性品質(zhì)。利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除影響玉米賴氨酸含量的基因O2，顯著增加了O2突變玉米賴氨酸含量，對(duì) fl2、opaque7、opaque6、De-30等進(jìn)行基因編輯，不同程度地改變了胚乳的氨基酸組成，增加了賴氨酸含量[24]?；蚓庉嫾夹g(shù)已成為快速、定向改良作物產(chǎn)量與品質(zhì)的重要工具。

（2）抗逆與抗病性能提升

稻瘟病是危害水稻最嚴(yán)重的病害之一。靶向敲除負(fù)調(diào)控水稻的稻瘟病抗性基因OsERF922，獲得的T2純合突變系在苗期和分蘗期對(duì)稻瘟病菌的抗性顯著提高[25]。美國對(duì)Sweet14基因進(jìn)行編輯，獲得了抗白葉枯病的水稻[26]。我國首次對(duì)小麥MLO進(jìn)行基因編輯，獲得了對(duì)白粉病具有廣譜抗性的小麥材料。ARGOS8是一個(gè)乙烯響應(yīng)負(fù)調(diào)控因子，干旱脅迫過表達(dá)ARGOS8的玉米比野生型顯著增產(chǎn)。利用基因編輯技術(shù)使 ARGOS8表達(dá)量顯著增加，這些突變體在干旱環(huán)境下的產(chǎn)量比野生型玉米產(chǎn)量有顯著提升[27]。

3. 突破了動(dòng)物疫苗研發(fā)與致病機(jī)制研究瓶頸

我國利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和Cre/Lox系統(tǒng)對(duì)偽狂犬病毒進(jìn)行基因編輯，構(gòu)建了第一個(gè)基因編輯候選疫苗。但是，該系統(tǒng)不適用于所有物種，尤其是結(jié)核分枝桿菌等病原微生物。而基于三型CRIPSR/Cas10系統(tǒng)的新型CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)，則可用于不同病原微生物基因組編輯，制備新的基因編輯疫苗（如偽狂犬病毒、非洲豬瘟病毒、結(jié)核分枝桿菌等）。此外，聚焦型或全基因組文庫CRISPRi篩選技術(shù)也被用于篩選人或小鼠病毒受體，以及動(dòng)物病毒受體基因，尋找與病毒復(fù)制相關(guān)的關(guān)鍵因子。如利用全基因組文庫CRISPRi篩選技術(shù)鑒定出了宿主識(shí)別細(xì)菌ADP-heptose的受體。

三、基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)化前景

（一）基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)化需求旺盛

CRISPR/Cas9基因編輯作為一種革命性技術(shù)，不但轟動(dòng)了學(xué)術(shù)界、產(chǎn)業(yè)界，也對(duì)資本產(chǎn)生了巨大吸引力。伴隨其向農(nóng)業(yè)育種等領(lǐng)域的逐漸滲透，先后取得了抗藍(lán)耳病豬、無角牛、磷高效玉米培育等一系列突破性進(jìn)展，并逐漸走向產(chǎn)業(yè)化。2014年，美國密蘇里大學(xué)通過基因編輯成功獲得完全抵抗藍(lán)耳病的CD163敲除豬。國際著名豬育種公司英國Genus PLC公司與美國密蘇里大學(xué)合作，共同開展抗藍(lán)耳病新品種豬的系統(tǒng)培育工作，并于2015年宣布，5年后將抗藍(lán)耳病新品種豬提供給豬肉生產(chǎn)商。目前，該公司已相繼拿到CD163基因、分子剪刀等知識(shí)產(chǎn)權(quán)許可，并培育出祖代抗藍(lán)耳病豬群體[28]。與動(dòng)物研究相比，植物基因組編輯產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用相對(duì)成熟，已經(jīng)開始商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用，早在2012年，美國政府就批準(zhǔn)了首個(gè)基因組定向修飾的磷高效玉米，可以作為常規(guī)品種直接進(jìn)行田間評(píng)價(jià)?；蚓庉嫾夹g(shù)在植物抗病、抗除草劑、提升品質(zhì)與產(chǎn)量方面的巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值，驅(qū)動(dòng)了拜耳公司、先正達(dá)公司、孟山都公司、杜邦-先鋒公司的產(chǎn)業(yè)化研發(fā)步伐，新型基因組編輯技術(shù)，創(chuàng)建新型基因編輯農(nóng)作物品種。

（二）基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)化市場規(guī)模預(yù)測

隨著技術(shù)研發(fā)的深入，基因編輯的技術(shù)優(yōu)勢不斷凸顯，并逐漸轉(zhuǎn)化為產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢，已經(jīng)在動(dòng)植物育種方面顯示了廣闊的前景。據(jù)美國Kalorama Information公司估計(jì)，2025年基因編輯及其相關(guān)供應(yīng)市場規(guī)模有望突破50億美元。以我國為例，2017年生豬存欄40 350萬頭，肉牛存欄10 008.5萬頭，奶牛存欄1 376.6萬頭，肉羊存欄30 314萬頭，我國已成為名副其實(shí)的畜牧業(yè)大國。然而，隨著人口增加，對(duì)畜產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)的需求不斷增加，家畜存欄還將大幅增加，如以10%～20%的動(dòng)物個(gè)體由基因編輯動(dòng)物替代計(jì)算，我國的市場規(guī)模也相當(dāng)可觀。同樣，農(nóng)作物市場規(guī)模也很大，經(jīng)濟(jì)效益更為明顯。美國杜邦公司（DuPont）是最大的轉(zhuǎn)基因作物銷售公司之一，據(jù)其測算，首批基因編輯食物將會(huì)在5年內(nèi)被端上餐桌。

四、基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展建議

盡管基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)化與市場需求結(jié)合緊密，產(chǎn)業(yè)化前景誘人，但其產(chǎn)業(yè)化仍然受到一些瓶頸問題的制約：①CRISPR/Cas9系統(tǒng)自身技術(shù)問題。目前該技術(shù)基因編輯效率相對(duì)較低，且靶點(diǎn)特異性有待提高。②CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)業(yè)化中的技術(shù)壁壘問題。CRISPR/Cas9技術(shù)原始創(chuàng)新來源于美國科學(xué)家，知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬美國，該技術(shù)在農(nóng)業(yè)育種中的應(yīng)用，必將涉及知識(shí)產(chǎn)權(quán)問題。需要深入開展相關(guān)基礎(chǔ)研究，研發(fā)新的基因編輯技術(shù)，繞開專利侵權(quán)問題。③基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)化法律、法規(guī)問題。基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，很大程度上取決于其對(duì)應(yīng)的法律、法規(guī)政策的完善與否。歐美在相關(guān)法律、法規(guī)立法方面走在世界前列，基因編輯技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)有本質(zhì)區(qū)別，我國應(yīng)針對(duì)基因編輯技術(shù)制定相關(guān)法規(guī)，為基因編輯的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供法律保障。因此，在基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中，有必要協(xié)調(diào)好以下幾方面的工作。

（一）謀劃布局科技項(xiàng)目

加強(qiáng)科技計(jì)劃頂層設(shè)計(jì)和整體布局，面向基因編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用推廣問題，開展前沿性、原創(chuàng)性基礎(chǔ)應(yīng)用研究，面向未來20年我國經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的重大戰(zhàn)略需求，規(guī)劃啟動(dòng)并實(shí)施一批農(nóng)業(yè)領(lǐng)域基因編輯科技項(xiàng)目。

（二）著力推動(dòng)“產(chǎn)學(xué)研”一體化

基因編輯屬于知識(shí)密集型技術(shù)，產(chǎn)業(yè)化發(fā)展需要“產(chǎn)學(xué)研”一體化模式。以農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目為載體，培養(yǎng)和凝聚一批能支撐產(chǎn)業(yè)發(fā)展創(chuàng)新的領(lǐng)軍人才、優(yōu)秀團(tuán)隊(duì)，為基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)化提供智力支撐。鼓勵(lì)高校、科研機(jī)構(gòu)開展多種形式的農(nóng)業(yè)科技合作與科技成果轉(zhuǎn)化活動(dòng)，加大企業(yè)、社會(huì)資本共同參與的風(fēng)險(xiǎn)投資，解決“產(chǎn)學(xué)研”聯(lián)合中的資金不足問題，切實(shí)推動(dòng)基因編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

（三）引導(dǎo)社會(huì)資金投入

基因編輯作為高新技術(shù)必將推動(dòng)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的革命性改變，帶來的經(jīng)濟(jì)效益不可估量。政府在增加對(duì)農(nóng)業(yè)基因編輯技術(shù)研發(fā)投入的同時(shí)，應(yīng)制定各種優(yōu)惠政策，鼓勵(lì)引導(dǎo)社會(huì)資金投入，加快基因編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的產(chǎn)業(yè)化步伐。

（四）建立與完善法律、法規(guī)

基因編輯是一種新型的動(dòng)植物遺傳改良技術(shù)，與轉(zhuǎn)基因育種有本質(zhì)區(qū)別，發(fā)達(dá)國家已經(jīng)建立了相應(yīng)配套的法律、法規(guī)。而我國尚未制定基因編輯的相關(guān)法規(guī)，政府部門應(yīng)緊跟技術(shù)發(fā)展潮流，出臺(tái)關(guān)于農(nóng)業(yè)基因編輯產(chǎn)品的相關(guān)法規(guī)及實(shí)施細(xì)則，為農(nóng)業(yè)領(lǐng)域基因編輯技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展鋪平道路。