黑龍江馬鈴薯黑痣病菌生物學特性及菌絲融合群的鑒定

牟明　趙偉　楊明秀　宋爽　張俊華

摘要：采用生長速度法研究了黑龍江省馬鈴薯黑痣病菌菌絲生長的條件、黑痣病菌的生物學特性及菌絲融合群情況，為病害的防治提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，黑痣病病菌菌絲的適宜生長條件為25～30℃，低溫情況下生長速度緩慢且在5℃不生長；最適合生長的pH值為7；黑暗環(huán)境更適合黑痣病病菌的生長；在本試驗的幾種碳源中，最利于病菌生長的是可溶性淀粉，在本試驗的幾種氮源中，最有利于病菌生長的是酵母粉。從黑龍江省7個馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集馬鈴薯黑痣病樣品100份，融合群測定結(jié)果表明，這些菌株分別屬于AG-8、AG-6、AG-5、AG-4、AG-1-IC、AG-3和AG-1-IA融合群，其中AG-1-IA群有8個菌株，AG-1-IC群有13個菌株，AG-3群有10個菌株，AG-4群有20個菌株，AG-5群有17個菌株，AG-6群有10個菌株，AG-8群有14個菌株，其中AG-4為優(yōu)勢菌群。黑龍江省的馬鈴薯黑痣病菌融合群分布比較復雜，同一地點可能出現(xiàn)不同的融合群，同一融合群也會在不同的地區(qū)出現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；立枯絲核菌；生物學特性；菌絲融合群

馬鈴薯黑痣病是一種非常嚴重的土傳病害，主要是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）所引起，在馬鈴薯塊莖及土壤中越冬存活。馬鈴薯黑痣病發(fā)病區(qū)域非常廣泛，在世界各地均有發(fā)生。據(jù)報道，AG-3是立枯絲核菌主要的融合群，常常引起黑脛病、莖腐或匍匐莖腐爛，而AG-1、AG-2、AG-4、AG-5和AG-7等融合群也有相關(guān)研究報道。AG-2型病原菌存在3種基因型，其中AG-2-1550 bp的致病性是最強的，是導致匍匐莖和莖壞死的主要基因型，另外2個基因型的致病性較弱，僅會導致較小的病斑，而AG-3型病原菌主要對匍匐莖、塊莖及莖進行侵染，致病能力很強。在田間試驗和培養(yǎng)基中對塊莖的檢測都表明AG-3型病原菌其菌核的數(shù)量多于AG-2和AG-5型病原菌。AG-8型病原菌卻只有對根部的侵染能力，對植株其他部位不具備侵染能力，而AG-7型病原菌卻與之相反，不能侵染根部。生物學特性方面，李乾坤等對甘肅省馬鈴薯種植區(qū)采集的黑痣病菌菌株進行分離，研究表明，菌絲生長溫度最低為4℃，最適為23℃，34℃時停止生長，劉寶玉等對內(nèi)蒙古馬鈴薯種植區(qū)的馬鈴薯黑痣病菌菌株進行研究表明，菌絲生長最高pH為11，在pH為12時停止生長。

在黑龍江省，關(guān)于馬鈴薯黑痣病菌生物學特性的研究還比較少，融合群的鑒定分析研究接近空白，這使黑龍江省馬鈴薯黑痣病的防控缺少理論依據(jù)。筆者從黑龍江省7個馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集分離得到100個馬鈴薯黑痣病菌菌株，通過對病菌生物學特性進行研究及菌絲融合群鑒定分析，為黑龍江省馬鈴薯黑痣病病害的發(fā)生及防治提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

2014-2015年從黑龍江克山、大慶、雙城、綏化、克東、呼蘭、黑河7個馬鈴薯種植區(qū)按種植面積的大小平均采集分離得到馬鈴薯黑痣病標本100份。標準菌株AG-8、AG-6、AG-5、AG-4、AG-1-IC、AG-3和AG-1-IA由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院與中國農(nóng)業(yè)大學植物保護學院提供。

1.2方法

1.2.1黑龍江馬鈴薯黑痣病菌生物學特性研究 從馬鈴薯塊莖上選取菌核，先放入酒精中消毒30s，再在HgCl₂中二次消毒2-3min，然后用無菌水沖洗，吸干表面水分后放人事先準備好的PDA上，保證每個PDA板上有3～4塊菌核，培養(yǎng)溫度設置在25℃，培養(yǎng)1～2d，待長出菌絲后，挑取尖端的菌絲，繼續(xù)在PDA中純化培養(yǎng)，判斷立枯絲核菌的標準是有孢子、菌絲分枝或菌核的出現(xiàn)。確定是立枯絲核菌后，4℃保存在PDA斜面上備用。

將全部活化后的供試菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上培養(yǎng)，待培養(yǎng)基長滿菌絲后，用5mm的打孔器沿著培養(yǎng)基最外圈的菌絲進行打孔，然后將所得的所有菌碟轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基的正中心位置培養(yǎng)，處理36h后利用十字交叉法測量菌落的直徑。

設置5、10、15、20、25、30、35℃共7個處理，3次重復，研究溫度對菌絲生長的影響。

設置連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、12h光暗交替3個處理，3次重復，研究光照對菌絲生長的影響。

得到菌碟后分別用1mol·L^-1HCL和NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，將菌碟分別放置在pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12共10種培養(yǎng)基中，25℃恒溫倒置培養(yǎng)，每個處理3次重復，研究pH對菌絲生長的影響。

查氏培養(yǎng)基：2g KNO₃，1g KH₂PO₄，0.5g KCl，0.01g FeSO₄，0.5g MgsO₄·7H₂O，20g瓊脂，30g蔗糖，1000g蒸餾水。將以下4種碳源替代蔗糖，供試碳源：麥芽糖、可溶性淀粉、葡萄糖、果糖，以不加碳源作為對照；將以下4種氮源替代KNO₃，供試氮源：酵母粉、尿素、蛋白質(zhì)、硝酸鈉，以不加氮源作為對照。分別設置5個處理，3次重復，將菌碟接種于不同碳源培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)，研究不同碳源、氮源對菌絲生長的影響。

1.2.2菌絲融合群鑒定 利用載玻片配對法將供試菌株和標準菌株的融合反應做鑒定試驗，操作如下：首先，將事先準備好的標準菌株和待測菌株25℃恒溫處理72h，然后利用打孔器選取5mm的菌落，在滅菌的載玻片上用移液槍打一層PDA培養(yǎng)基，將標準菌株放置在載玻片的中間，待測菌株放在標準菌株的兩側(cè)，間隔1.5-2.0cm，然后將該載玻片放入無菌培養(yǎng)皿加無菌水，25℃恒溫培養(yǎng)24～36h，直到2種菌株邊緣生長到一起并且交叉5mm左右時，利用顯微鏡觀察菌絲融合的情況，3次重復。分3種情況進行鑒定，如表1所示。

2結(jié)果與分析endprint

2.1黑龍江馬鈴薯黑痣病菌生物學特性

2.1.1溫度對病菌菌絲生長的影響 病菌菌絲在不同培養(yǎng)溫度下菌落生長速度不同，其中5℃條件下不生長、10～35℃條件下可以生長，且在10～30℃之間菌落直徑隨溫度的升高明顯增大，在30℃時達到最大值，當溫度大于30℃時菌落直徑隨著溫度的升高明顯變小。因此，25～30℃的培養(yǎng)條件利于黑痣病菌生長，30℃是其最適培養(yǎng)溫度。多重比較結(jié)果表明，菌株在不同溫度處理間，菌絲生長速度差異顯著（圖1）。

2.1.2光照對菌絲生長的影響 對供試菌株病菌菌絲進行全光照、全黑暗、光暗交替處理，結(jié)果表明，全黑暗條件下菌絲生長速度最快，菌落平均直徑為75.8mm；光暗交替條件下生長速度次之，菌落平均直徑為71.8mm；在全光照條件下生長速度最慢；多重比較結(jié)果表明，全黑暗與光暗交替處理間差異不顯著，但與全光照處理間差異顯著（圖2）。

2.1.3不同pH對菌絲生長的影響 病菌菌絲的生長在不同pH條件下速度不同，pH在3～12范圍內(nèi)馬鈴薯黑痣病菌菌絲均可生長，其中菌絲的生長速度較快的pH范圍為5～8，且在pH=7時，菌絲生長速度最快，pH=12時，菌絲生長速度最慢。多重比較結(jié)果表明，pH=3和pH=4、pH=5和pH=8處理間的菌絲生長速度差異不顯著，其余各pH處理間菌絲生長速度差異顯著（圖3）。

2.1.4不同碳源對菌絲生長的影響 由表2可知，病菌在供試的5種碳源中均可生長，其中，在可溶性淀粉培養(yǎng)基中生長的菌落直徑最大，蔗糖其次，而在果糖培養(yǎng)基中生長的菌落直徑最小。

2.1.5不同氮源對菌絲生長的影響 由表3可知，病菌在所提供的5種氮源中均可生長，其中，在酵母粉培養(yǎng)基中生長的菌落直徑最大，蛋白胨培養(yǎng)基其次，而在尿素培養(yǎng)基中菌絲生長效果最差。

2.2黑龍江馬鈴薯黑痣病菌融合群鑒定

2.2.1菌絲融合觀察 對菌絲融合進行觀察是很直觀的檢測融合結(jié)果的方法，但菌絲融合存在不同的形式，因此，根據(jù)不同的融合形態(tài)將菌絲融合分為3種類型：A-不融合，B-完全融合，C-不完全融合（圖4）。其中完全融合也分為3種情況，頂端對頂端的融合、頂端對側(cè)枝的融合、側(cè)枝對側(cè)枝的融合。

2.2.2菌絲融合群的鑒定 對所收集的黑龍江省雙城（SC）、大慶（DQ）、克山（KS）、克東（KD）、黑河（HH）、呼蘭（HL）、綏化（sH）共7個地區(qū)的病菌菌株進行菌絲融合群鑒定，根據(jù)7個標準菌株可將供試菌株分為7個群，其中，AG-1-IA群有8個菌株，AG-1-IC群有13個菌株，AG-3群有10個菌株，AG-4群有20個菌株，AG-5群有17個菌株，AG-6群有10個菌株，AG-8群有14個菌株（表4）。說明馬鈴薯立枯絲核菌菌絲融合群在黑龍江省的分布是較廣泛的。由以上數(shù)據(jù)可知，AG-4的分離頻率最大，其次是AG-5，AG-8，AG-I-IC，AG-3，AG-6和AG-I-IA。

2.2.3馬鈴薯黑痣病菌融合群分布頻率 對收集的100個菌株經(jīng)過融合群分析鑒定之后，將黑龍江省的菌株分為7個群，分別是AG-4、AG-5、AG-6、AG-8、AG-1-IC、AG-3和AG-1-IA。其中，AG-I-IA在克山縣、綏化市、大慶市和呼蘭區(qū)均有分布，AG-I-IC在大慶市、克山縣、克東縣和雙城區(qū)均有分布，AG-3在雙城區(qū)、克山縣和綏化市有分布，AG-4在綏化、大慶市、克山縣、雙城區(qū)均有分布，AG-5在雙城區(qū)、綏化市、大慶市、呼蘭區(qū)、克山縣和黑河均有分布，AG-6在雙城區(qū)、大慶市、綏化市和呼蘭區(qū)均有分布，AG-8在克東縣、綏化市、克山縣、大慶市均有分布。其中AG-4出現(xiàn)頻率最高，為20%，是優(yōu)勢菌群（表5）。

3討論與結(jié)論

馬鈴薯黑痣病在我國最早是1922年在臺灣發(fā)現(xiàn)的，到目前為止，它的發(fā)生已經(jīng)非常普遍。病菌侵染幼芽，導致幼芽出土前腐爛甚至死亡形成芽腐，造成缺苗；侵染植株莖基產(chǎn)生凹陷褐色病斑，嚴重的導致立枯、葉片卷曲及頂端萎蔫的癥狀；侵染薯塊導致其表面產(chǎn)生大小、形狀不規(guī)則的黑色菌核。本研究結(jié)果表明，馬鈴薯黑痣病菌菌絲適宜生長條件為25～30℃，低溫情況下生長速度緩慢且在5℃以下不生長；而甘肅省馬鈴薯種植區(qū)采集的黑痣病菌菌株菌絲生長溫度最低為4℃，最適為23℃，34℃時停止生長。筆者分離菌株的菌絲最適生長pH為7；而內(nèi)蒙古馬鈴薯種植區(qū)的馬鈴薯黑痣病菌菌絲最高生長pH為11，在pH為12時則停止生長，并且黑暗環(huán)境更適合病菌生長。筆者比較了幾種不同碳源和氮源對馬鈴薯黑痣病菌菌絲生長的影響，結(jié)果表明，在幾種碳源中，最利于病菌生長的是可溶性淀粉，而在參與試驗的幾種氮源中，最有利于病菌生長的是酵母粉，這為以后黑痣病菌的室內(nèi)培養(yǎng)和研究提供了參考資料。對比國內(nèi)其他研究結(jié)果和本研究結(jié)果可知，馬鈴薯黑痣病菌隨地域的不同而具有不同生長特性，并且適應特定的生長環(huán)境，其原因可能是病原菌屬于不同群屬，且在當?shù)靥囟ōh(huán)境中不斷進化適應。試驗得出的黑龍江馬鈴薯黑痣病菌適宜生長條件為黑龍江省馬鈴薯黑痣病的防治提供了理論依據(jù)，在實際應用中，在病菌適宜生長條件出現(xiàn)時能夠及時地進行預防。

有關(guān)立枯絲核菌分類，前人已經(jīng)有相關(guān)研究，目前被廣泛認可的分類方法是以菌絲融合的方式來確定融合群。利用菌絲融合群的方法，前人進行了親緣關(guān)系的研究。這些研究結(jié)果表明，融合群之間的差異明顯大于融合群內(nèi)獨立菌株的差異。因此，菌絲融合群的分類能夠鑒別出不同類型的種群。立枯絲核菌主要來源于水稻、小麥和棉花等，能夠引起多種植物發(fā)生病害，且其融合群較為多樣。例如AG-4是新疆和四川棉花上的主要融合群；AG-1-IA是四川、江蘇和廣西等地水稻和玉米上的優(yōu)勢融合群；AG-1和AG-2是上海、浙江、山東、河南以及陜西草坪上檢測到的立枯絲核菌融合群；AG-5是湖北小麥上立枯病絲核菌主要融合群。本試驗將黑龍江省馬鈴薯黑痣病融合群主要分為AG-8、AG-6、AG-5、AG-4、AG-I-IC、AG-3和AG-1-IA，其中AG-1-IA群有8個菌株，AG-1-IC群有13個菌株，AG-3群有10個菌株，AG-4群有20個菌株，AG-5群有17個菌株，AG-6群有10個菌株，AG-8群有14個菌株。另外有8個菌株沒有檢測到融合群，這8個菌株與所選標準菌株均不融合，其原因可能是本試驗所選用的標準菌株只有7株，并不能排除黑龍江省馬鈴薯黑痣病菌可能存在其他融合群，還有待于進一步研究。筆者還對黑龍江省馬鈴薯黑痣病菌菌絲融合群的分布進行了統(tǒng)計，結(jié)果表明，其分布非常廣泛，在分布上存在地域差異性。并且有別于中國北方馬鈴薯黑痣病菌融合群鑒定及遺傳多樣性分析試驗中AG-3是優(yōu)勢菌群、AG-4是次優(yōu)勢菌群的結(jié)果，本研究結(jié)果表明，AG-4為主要融合群，AG-3所占比例很少，此差異可能是所選取的菌株分離地域差異和試驗材料的生態(tài)類型差異所引起。對不同地域優(yōu)勢菌群的研究有利于對病原菌進行針對性防治，為緩解該病原菌引起的病害和減少病原菌引起的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失提供寶貴的理論支持。endprint