蘿卜中萊菔子素含量及其在冷藏過程中的變化分析

姚玉慶+普布多吉+劉辰+徐文玲+劉賢嫻+王淑芬

摘要：采用高效液相色譜法測定了43份蘿卜材料肉質(zhì)根中萊菔子素的含量，并分析了4份不同皮色和肉質(zhì)色蘿卜材料冷藏過程中萊菔子素含量和黑芥子酶活性的變化。結(jié)果表明：43份蘿卜材料肉質(zhì)根中均可檢測到萊菔子素成分，其含量范圍為43.26～468.27 μg/g，平均含量160.23 μg/g。冷藏4個月后，蘿卜肉質(zhì)根中黑芥子酶活性和萊菔子素含量均顯著下降，與采收時相比，16Q1、16Q56、16Q62和16Q154中黑芥子酶活性分別下降了61.41%、68.96%、44.60%和81.39%，萊菔子素含量分別下降了26.74%、74.77%、50.04%和81.71%。通過本試驗檢測發(fā)現(xiàn)，萊菔子素含量較高的種質(zhì)為紅皮白肉類型，這為蘿卜新品種選育及品種改良提供了依據(jù)和材料；明確了冷藏超過2個月后，蘿卜肉質(zhì)根中的萊菔子素含量和黑芥子酶活性大幅下降，今后需要發(fā)展新的貯藏技術(shù)以滿足長期貯藏的要求。

關(guān)鍵詞：蘿卜；肉質(zhì)根；萊菔子素；高效液相色譜；冷藏

中圖分類號：S631.109文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）01-0029-05

Abstract Total 43 radish （Raphanus sativus L.） germplasms were used to detect the sulforaphene content in roots by high performance liquid chromatography， and 4 radish germplasms with different skin and fleshy colors were detected the variation of sulforaphene content and myrosinase activity during chilled storage. The results showed that sulforaphene could be detected in all the 43 radish roots， and the contents ranged from 43.26 μg/g to 468.27 μg/g with the mean of 160.23 μg/g.After 4 months of chilled storage， the myrosinase activity and sulforaphene content in radish roots reduced significantly， and those of 16Q1， 16Q56， 16Q62 and 16Q154 reduced by 61.41% and 26.74%， 68.96% and 74.77%， 44.60% and 50.04%， 81.39% and 81.71% respectively compared with the harvest value. This study discovered that the radish germplasms with red skin and white flesh had the higher sulforaphene content， which provided scientific bases and resources for breeding and development of new radish germplasms. And the sharp decrease of the myrosinase activity and sulforaphene content of radish roots was confirmed after 2 months of chilled storage， so new storage technologies needed to be developed to meet the demand of long-term storage.

Keywords Radish；Fleshy root；Sulforaphene；High performance liquid chromatography；Chilled storage

蘿卜（Raphanus sativus L.），又稱萊菔，十字花科蘿卜屬異花授粉、一年或兩年生草本植物，根類蔬菜，在我國已有2 700多年的栽培歷史。蘿卜根、莖葉、莢和芽苗都可食用，富含碳水化合物、VC、葉酸、抗氧化酶、蛋白質(zhì)、纖維素等多種營養(yǎng)成分，對人體健康有非常重要的作用。

蘿卜不僅同其他十字花科植物一樣，含有多種硫代葡萄糖苷[1]，還富含其他十字花科蔬菜沒有的蘿卜苷（glucoraphenin，RAE）。RAE被黑芥子酶水解后可生成一種生物活性物質(zhì)——萊菔子素（sulforaphene，SFE）。目前，十字花科蔬菜中，僅在蘿卜中檢測到此物質(zhì)。萊菔子素是異硫氰酸酯的一種，在抑制細(xì)胞突變和抗氧化活性方面具有重要作用[2]。研究表明，萊菔子素對突變活性的抑制是萊菔硫烷的1.3～1.5倍[3]，在抑制肺癌A549細(xì)胞作用中反應(yīng)最為敏感[4]。挖掘富含萊菔子素的蘿卜種質(zhì)資源，將為選育蘿卜抗癌新品種及研究萊菔子素活性提供材料和依據(jù)。

目前，關(guān)于蘿卜中硫代葡萄糖苷含量的研究較為深入。楊麗娟等（2010）[5]對蘿卜葉和肉質(zhì)根中的硫代葡萄糖苷組分和含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明蘿卜這兩個器官中脂肪族硫苷組分相同，主要硫苷組分都是4-甲基硫代-3-丁烯基硫苷，并且都含有萊菔子素的前體物質(zhì)RAE；同時指出RAE在肉質(zhì)根中相對含量較少（0.16%～3.85%）。張麗等（2012）[6]也證實了蘿卜幼苗中含有RAE。與硫代葡萄糖苷含量的研究相比，蘿卜肉質(zhì)根中萊菔子素含量的研究鮮有報道。endprint

低溫冷藏能保持果蔬原有的色澤、風(fēng)味和營養(yǎng)價值，是貯藏中減少果蔬營養(yǎng)損失的一種較好方法。目前已有多種果蔬的冷藏研究報告[7-16]，如魏永義等[12]研究發(fā)現(xiàn)白蘿卜維生素C在低溫冷藏方式中損失最為緩慢；楊國俊等[13]通過連續(xù)10 d的測定表明，冷藏處理能有效緩解胡蘿卜中葉綠素和維生素C的流失速度；陳澍棠[14]的研究也表明低溫可有效抑制西蘭花的呼吸強(qiáng)度，減緩葉綠素的分解，初夏采收后，在0～2℃可保綠20天以上；張靜等[15]發(fā)現(xiàn)低溫冷藏（4℃）可以降低沾化冬棗的乙烯釋放量，抑制其呼吸，減少貯藏物質(zhì)消耗，減緩生命活動進(jìn)程，利于延長貯藏保鮮期；王蘭菊等[16]也證實低溫貯藏可顯著減少山藥塊莖營養(yǎng)物質(zhì)及水分的損失，使產(chǎn)品保持較高的商品性。但有關(guān)冷藏條件下蘿卜萊菔子素含量和芥子酶活性變化的研究還未見報道。

本試驗采用高效液相色譜法（HPLC）測定了43份蘿卜材料肉質(zhì)根中萊菔子素含量，并分析了冷藏條件下4份蘿卜材料肉質(zhì)根中萊菔子素含量和黑芥子酶活性的變化規(guī)律，以期為蘿卜品種改良及新品種選育提供材料和依據(jù)，并為開發(fā)蘿卜肉質(zhì)根長期貯藏技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以2016年種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗田的43份蘿卜材料為試材。采收期，每份蘿卜材料選取6個單株的肉質(zhì)根，取中間部位利用四分法取對角線部位，切成小丁混合取樣，液氮快速冷凍后超低溫保存；樣品經(jīng)冷凍干燥機(jī)真空冷凍干燥，研磨機(jī)粉碎成粉末，過60目篩，保存于超低溫冰箱中備用。

收獲期采收16Q1、16Q56、16Q62和16Q154 四份材料中大小一致、無機(jī)械損傷、成熟度一致的單株肉質(zhì)根，洗凈晾干，放入4℃冷藏倉庫，每隔1個月取樣一次，每份材料設(shè)置3個重復(fù)。

1.2 萊菔子素含量測定

稱取蘿卜粉末0.2 g，按固液比1∶20的比例加入pH 5.0的磷酸緩沖液混合均勻，20℃超聲20 min，25℃酶解1 h，然后加入45 mL乙酸乙酯室溫萃取30 min，經(jīng)6 000 r/min離心3 min，取上清液；重復(fù)萃取2次后合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干，最后用10 mL色譜甲醇定容，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待HPLC定量分析。

HPLC測定條件：采用安捷倫HPLC-1200高效液相色譜儀，DAD檢測器，C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），柱溫40℃，檢測波長254 nm，自動進(jìn)樣量1.0 μg/mL，流動相A為水，流動相B為純甲醇，流速1 mL/min，洗脫梯度見表1。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將10 mg萊菔子素標(biāo)準(zhǔn)品溶于10 mL色譜甲醇中，避光保存在冰箱中。將萊菔子素標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別稀釋成濃度為25、50、75、150、200、300 μg/g的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行高效液相色譜分析，以測得的萊菔子素峰面積為橫坐標(biāo)（X），萊菔子素濃度（μg/g）為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

Y=0.077X-1.562，R2=0.996 。

1.3 黑芥子酶活性測定

黑芥子酶提取測定參考張蕾等[17]的方法。準(zhǔn)確稱取1.5 g樣品粉末，加入10 mL預(yù)冷的10 mmol/L磷酸鉀緩沖液（含1 mmol/L EDTA、3 mmol/L二硫蘇糖醇、5%甘油，pH 7.2），4℃、1 200 r/min離心20 min，取上清液作為酶液備用。

黑芥子酶活性測定參照Eylen等[18]的方法，略有改進(jìn)。取0.0667 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）1.50 mL、1 mmol/L抗壞血酸溶液500 μL、25.18 mmol/L 黑芥子硫苷酸鉀溶液50 μL和酶液20 μL，分別保溫至37℃，混合平衡1 min。置于1 cm光路石英比色皿中，37℃反應(yīng)30 min，測定227 nm處吸光度，按式（1）計算酶活力。

式中：N為反應(yīng)時間內(nèi)黑芥子酶降解黑芥子硫苷酸鉀的量，μmol；t為反應(yīng)時間，min；VE為酶液體積，mL；VEX為提取液體積，mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別取25.18 mmol/L黑芥子硫苷酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品0、12.5、25.0、37.5、50.0、70.0 μL，用緩沖液定容至2.00 mL，測定其在227 nm處的吸光度，以濃度（mmol/L）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.9484X-0.0028，R2=0.9994 。

酶活力單位定義[16]：在pH 6.5、37℃條件下，1 min催化1 μmol黑芥子硫苷酸鉀所需要的酶量為1個活力單位（U）。酶比活力（U/mg）定義為每毫克蛋白質(zhì)中黑芥子酶的活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜肉質(zhì)根中萊菔子素含量分析

2.1.1 不同皮色和肉色蘿卜材料肉質(zhì)根中萊菔子素含量 從表2可以看出，43份蘿卜材料肉質(zhì)根中均檢測到萊菔子素，其含量范圍為43.26～468.27 μg/g，平均含量160.23 μg/g，其中紅皮白肉材料16Q82中萊菔子素含量最高。綜合來看，紅皮白肉蘿卜材料肉質(zhì)根中萊菔子素平均含量最高，為374.99 μg/g；其次是綠皮紅肉材料，為268.64 μg/g；白皮白肉蘿卜肉質(zhì)根中萊菔子素含量相對較低，平均含量108.30 μg/g；綠皮綠肉蘿卜比白皮白肉蘿卜肉質(zhì)根中萊菔子素含量略高，平均含量為166.83 μg/g。

2.1.2 不同區(qū)段萊菔子素含量的蘿卜種質(zhì)分布頻次 由圖1可見，有16份蘿卜材料的肉質(zhì)根萊菔子素含量分布在>100～≤200 μg/g范圍內(nèi)，15份材料分布在>0～≤100 μg/g范圍內(nèi)，7份材料分布在>200～≤300 μg/g范圍內(nèi)，分布在>300～≤400 μg/g和400 μg/g以上的蘿卜材料較少，分別為3份和2份。表明，大部分蘿卜材料肉質(zhì)根中的萊菔子素含量在0～200 μg/g之間，超過300 μg/g的較少。由此，可初步篩選出肉質(zhì)根中高萊菔子素含量的蘿卜種質(zhì)，即：綠皮綠肉的16Q25和16Q53，紅皮白肉的16Q62和16Q82，綠皮紅肉的16Q56。endprint

2.2 冷藏條件下蘿卜肉質(zhì)根中黑芥子酶活性及萊菔子素含量的變化

2.2.1 冷藏對蘿卜肉質(zhì)根中黑芥子酶活性的影響 蘿卜肉質(zhì)根中的黑芥子酶活性影響著其萊菔子素含量的變化。由圖2可見，4份蘿卜材料在冷藏條件下的黑芥子酶活性變化趨勢基本一致，即隨著冷藏期的延長，先經(jīng)過一段相對平穩(wěn)的變化期后大幅降低。冷藏1個月，4份材料的黑芥子酶活性變化很小。冷藏超過1個月，16Q154的黑芥子酶活性快速下降，冷藏2個月與采收時相比下降了43.65%，之后降幅變緩。16Q56的黑芥子酶活性在冷藏1個月后也開始逐漸降低，2個月后大幅降低。16Q1和16Q62冷藏2個月內(nèi)活性幾乎無變化，但超過2個月后降幅加大。至冷藏4個月時，16Q62的黑芥子酶活性降幅最小，其余依次為16Q1、16Q56、16Q154，與采收時相比，分別下降了44.60%、61.41%、68.96%、81.39%。

2.2.2 冷藏條件下蘿卜肉質(zhì)根中萊菔子素含量的變化 冷藏1個月，16Q62、16Q56和16Q154肉質(zhì)根中的萊菔子素含量均增加，其中16Q154的增幅最大，與采收時相比增加了100 μg/g；16Q1肉質(zhì)根中的萊菔子素含量略有降低，但降幅很小。之后，16Q62和16Q154的萊菔子素含量快速下降，而16Q56和16Q1的含量持續(xù)上升，至冷藏2個月后下降。冷藏4個月后，4份蘿卜材料肉質(zhì)根中的萊菔子素含量由高到低依次為16Q62、16Q1、16Q56、16Q154，與采收時相比，分別下降了50.04%、26.74%、74.77%、81.71%，其中，16Q154含量明顯低于其他蘿卜材料。

3 討論與結(jié)論

我國是蘿卜發(fā)源地之一，在全國廣泛種植，據(jù)《中國農(nóng)業(yè)統(tǒng)計資料2006》顯示，蘿卜年栽培面積和總產(chǎn)量均位居我國各類栽培蔬菜的前三。蘿卜口感脆嫩，甜辛適宜，廣受人們喜愛。其含有的生物活性物質(zhì)萊菔子素已被證實具有降低癌癥患病的功能，這進(jìn)一步提高了人們對蘿卜營養(yǎng)價值和醫(yī)學(xué)價值的認(rèn)識。本試驗對蘿卜肉質(zhì)根中萊菔子素含量及其在低溫冷藏條件下的變化進(jìn)行了分析，豐富了有關(guān)蘿卜萊菔子素的研究理論。

許多研究表明，不同蔬菜、不同品種間硫代葡萄糖苷含量差異較大，這可能與基因型有較大關(guān)系。Mithen等[19]研究了19種十字花科蕓薹屬蔬菜中硫苷含量發(fā)現(xiàn)，抱子甘藍(lán)最高，為34.9 μmol/g，花椰菜含量最低，僅為1.8 μmol/g，差異最高達(dá)18倍。何洪巨等[20]對蕓薹屬中白菜類、芥菜類和甘藍(lán)類的硫代葡萄糖苷的組成和含量進(jìn)行了評價，結(jié)果表明不同品種中硫苷的類型和含量不同。Vallejo等[21]研究表明，生長條件一致的12個青花菜品種之間硫苷含量存在明顯差異，含量最高的品種I-9905為28.3 μmol/g，而含量最低的品種Pentathlon僅為3.0 μmol/g。謝祝捷等[22]研究表明，基因型對青花菜4-甲基亞磺酰丁基硫苷含量的影響極顯著。

本試驗對43份不同皮色肉色蘿卜材料肉質(zhì)根的萊菔子素含量進(jìn)行了分析，不同材料間的萊菔子素含量差異明顯，最高含量約是最低含量的10.8倍，綠皮綠肉的16Q25和16Q53、紅皮白肉的16Q62和16Q82、綠皮紅肉的16Q56萊菔子素含量較高，超過300 μg/g。總體來看，紅皮白肉類型的萊菔子素含量最高，其次是綠皮紅肉蘿卜、綠皮綠肉蘿卜、白皮白肉蘿卜。但就某一特定材料而言，其含量的分布并不是絕對的，例如有些綠皮綠肉材料的萊菔子素含量低于白皮白肉材料，這說明，蘿卜肉質(zhì)根中的萊菔子素含量可能也與基因型有較大關(guān)系。

此外，通過分析低溫貯藏4個月過程中蘿卜肉質(zhì)根中萊菔子素含量和黑芥子酶活性的變化發(fā)現(xiàn)，黑芥子酶活性在貯藏過程中呈現(xiàn)逐步下降的趨勢，16Q154、16Q56冷藏1個月后開始明顯下降，而16Q62和16Q1冷藏2個月后才開始下降顯著；萊菔子素含量總體來說表現(xiàn)為先上升后下降的變化規(guī)律，16Q62和16Q154冷藏1個月后開始明顯降低，而16Q56和16Q1冷藏2個月才開始明顯降低。綜合上述分析，蘿卜低溫冷藏的最佳貯藏期為1～2個月，這遠(yuǎn)不能滿足長期貯藏的要求，今后仍需開發(fā)新的采后處理和貯藏技術(shù)。

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