烏鱧不同組織DNA提取研究

肖暢+趙巖+肖明松

摘要 [目的]研究烏鱧的肌肉、肝臟、腎臟、尾鰭、鱗片、腸、鰓蓋、鰓等組織的DNA提取。[方法] 利用酚-氯仿法提取烏鱧的肌肉、肝臟、腎臟、尾鰭、鱗片、腸、鰓蓋、鰓等組織的DNA，采用紫外分光光度計法、瓊脂糖凝膠電泳法和PCR擴(kuò)增法檢測提取的DNA質(zhì)量。[結(jié)果] 結(jié)果表明，不同組織的DNA含量不同（0.370～0.975 μg/μL），其中肌肉、肝臟、腎臟和腸等組織DNA質(zhì)量較高，而尾鰭、鱗片、鰓和鰓蓋等組織DNA質(zhì)量較差。[結(jié)論] 烏鱧的肌肉、肝臟、腎臟和腸等組織提取的DNA可用于后續(xù)的分子生物學(xué)研究。

關(guān)鍵詞 烏鱧；DNA；酚-氯仿法

中圖分類號 Q95-336 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）01-0223-02

Study on DNA Extraction from Different Tissues of Ophiocephalus argus Cantor

XIAO Chang 1 ZHAO Yan 2 XIAO Ming-song 2

（1 2 Classes High School，Hefei 168 Middle School，Hefei Anhui 230000； 2 College of Life Science，Anhui Science and Technology University）

Abstract [Objective] To research DNA extraction from the muscles，liver，kidney，caudal fins，scales，intestines，operculum and gills of Ophioc-ephalus argus Cantor.[Methods]Genomic DNA from the muscles，liver，kidney，caudal fins，scales，intestines，operculum and gills of Ophiocephalus argus Cantor was extracted by phenol-chloroform.DNA concentration of various tissues of Ophiocephalus argus Cantor calculated by ultraviolet spectrophotometer tests and agarose gel electrophoresis.Mitochondrial DNA control region sequence of Ophiocephalus argus Cantor was amplified by PCR.[Results] The DNA concentration of different tissues of Ophiocephalus argus Cantor ranged from 0.370 to 0.975 μg/μL.The quality of DNA in muscle，liver，kidney and intestine was higher than that in caudal fin，scales，gills and gill cover.[Conclusion]DNA extracted from the muscle，liver，kidney and intestine of Ophicephalus argus Cantor can be used in subsequent molecular biology research.

Key words Ophiocephalus argus Cantor；DNA；phenol-chloroform extraction

烏鱧（Ophiocephalus argus Cantor），俗稱黑魚、才魚、烏魚等，是鱧科魚類中個體大、生長快、經(jīng)濟(jì)價值高的名貴經(jīng)濟(jì)魚類[1]。烏鱧肉質(zhì)細(xì)嫩，口味鮮美，且營養(yǎng)價值頗高，因而在國內(nèi)外市場深受歡迎，是人們喜愛的上乘菜肴。此外，烏鱧還具有去瘀生新、滋補(bǔ)調(diào)養(yǎng)、健脾利水的醫(yī)療功效。病后、產(chǎn)后以及手術(shù)后食用，有生肌補(bǔ)血、加速愈合傷口的作用[2]。除高原地區(qū)外，烏鱧主要分布在長江流域和黑龍江流域的大部分地區(qū)[3-4]。近年來，由于水利工程、產(chǎn)卵場的破壞、環(huán)境的污染及人為的濫捕等使野生烏鱧自然資源日漸衰竭，已經(jīng)不能再形成優(yōu)勢種群，甚至有些大型水域的烏鱧已經(jīng)滅絕，對烏鱧漁業(yè)資源造成了難以逆轉(zhuǎn)的破壞[5-6]。為了保護(hù)和開發(fā)野生烏鱧種質(zhì)資源，了解和研究其遺傳特性，分子生物學(xué)技術(shù)成為研究其遺傳特性和品種改良的有力工具之一，而提取高質(zhì)量的烏鱧基因組DNA 是進(jìn)行各種分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)和前提。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)烏鱧取自安徽省鳳陽縣燃燈水庫，數(shù)量為2尾，魚齡2齡左右，體長25 cm左右，體重0.33～0.41 kg，活魚運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 模板DNA的制備。將2尾活魚解剖，分別取烏鱧的肌肉、肝臟、腎臟、尾鰭、鱗片、腸、鰓蓋、鰓等組織（質(zhì)量為80～100 mg）。首先將研缽和石英砂預(yù)冷，然后將鱗片、鰓、鰓蓋、尾鰭等難裂解組織剪碎后放入研缽中，加入適量的石英砂，置于冰上充分研磨過濾，再將濾液轉(zhuǎn)移到離心管中，而肌肉、腎臟等易裂解組織剪碎后即可放入離心管中，DNA提取采用酚-氯仿法[6]。

1.2.2 DNA濃度的測定。取待測DNA 15 μL倒入5 mL離心管中，用TE緩沖液稀釋100倍混勻待測。將待測液分別放在260 nm和280 nm處測量其吸光值。對比不同組織來源的OD260/OD280值，判斷DNA的純度和濃度。若OD260/OD280值為1.8±0.1，則DNA較純；若OD260/OD280>1.8，說明樣品中有RNA存在；若OD260/OD280<1.6，則說明樣品中DNA不純。DNA濃度（μg/μL）=50×OD260×稀釋倍數(shù)÷1 000，（OD260值相當(dāng)于50 μg/mL DNA）。endprint

1.2.3 DNA 檢測和PCR擴(kuò)增。待測DNA樣品用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測其DNA 的完整性，并將DNA樣品置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ糜赑CR擴(kuò)增的2條引物為烏鱧線粒體控制區(qū)部分片段引物：L20110518（5-ACC CCTAAC TCC CAA AGC-3）和H20110518（5-ATC TTA ACA TCT TCA GTG-3）[6]，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為30 μL，其中含10×buffer反應(yīng)緩沖液3.0 μL，3 μL dNTP （2.5 mmol/L），0.4 mmol/L引物，0. 25 μL Taq酶（大連TaKaRa公司），模板DNA 1.0 μL，加滅菌蒸餾水至30.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，電泳結(jié)果在化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDoc XRS）中拍照、保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外分光光度檢測結(jié)果

利用紫外分光光度計法對2尾烏鱧不同組織DNA溶液共15個樣品進(jìn)行檢測，并根據(jù)吸光值計算DNA的濃度，具體見表1。一般認(rèn)為樣品的OD260/OD280值的正常范圍在1.65～1.87之間，若比值>1.80，表明樣品中可能有RNA存在，若比值<1.80，表明樣品中可能含有蛋白質(zhì)或苯酚等雜質(zhì)。由表1可知，烏鱧不同組織DNA的OD260/OD280的平均值為1.673，屬于正常水平。其中肌肉組織DNA的OD260/OD280的純度較高，其平均比值為1.811 5。鰓蓋OD260/OD280的值最?。?.423），表明鰓蓋DNA很不純，可能含有較多的蛋白質(zhì)或苯酚等雜質(zhì)。不同組織DNA濃度為0.370～0.975 μg/μL，平均DNA濃度為0.722 μg/μL。其中肌肉組織DNA濃度最高，平均濃度達(dá)到0.960 μg/μL，肝、腎臟和腸等組織的DNA濃度相對較高（0.830～0.960 μg/μL）。而鰓蓋的DNA濃度最低，僅有0.370 μg/μL。

2.2 DNA提取后的電泳檢測結(jié)果

利用瓊脂糖凝膠電泳法對2尾烏鱧的肌肉、肝臟、腎臟、尾鰭、鱗片、腸、鰓蓋、鰓等組織提取的DNA進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖1。由圖1可知，肌肉、肝臟、腎臟和腸組織的電泳條帶明亮清晰，基因組DNA較完整，而尾鰭、鱗片、鰓蓋和鰓組織提取的DNA電泳條帶模糊暗淡，DNA質(zhì)量都較低。這表明酚-氯仿法提取烏鱧肌肉、肝臟、腎臟和腸等組織的DNA效果好、質(zhì)量較高，而尾鰭、鱗片、鰓蓋和鰓組織中提取的DNA效果差、質(zhì)量低。

2.3 DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)電泳檢測結(jié)果，對烏鱧肌肉、肝臟、腎臟、尾鰭、腸和鰓等組織進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果見圖2。由圖2可知，除了尾鰭組織條帶模糊外，其他組織DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后均能得到非常整潔明亮的DNA條帶，表明從肌肉、肝臟、腎臟和腸組織中提取的DNA純度很高，提取效果很好，可為后續(xù)相關(guān)的分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。

3 結(jié)論與討論

DNA作為分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，其提取方法多種多樣。酚-氯仿抽提法、甲酰胺解聚法、異丙醇沉淀法、試劑盒快速抽提法等均能有效獲得DNA[7-8]。本試驗(yàn)利用酚-氯仿法提取烏鱧不同組織的DNA，由于氯化鈉、醋酸鈉、異戊醇和RNA酶等試劑的使用，既降低了試驗(yàn)成本又簡化了試驗(yàn)流程。通過對烏鱧肌肉、肝臟、腎臟、尾鰭、鱗片、腸、鰓蓋、鰓等組織提取的DNA紫外分光光度檢測和凝膠電泳檢測結(jié)果比較可知，肌肉、肝臟、腎臟和腸等組織的DNA提取效果較好，而尾鰭、鱗片、鰓和鰓蓋等組織的DNA提取效果較差。導(dǎo)致這樣的結(jié)果可能有以下原因：一是肌肉等組織材質(zhì)柔軟易被裂解，而尾鰭、鰓蓋等組織比較堅硬，裂解困難；二是尾鰭、鰓蓋等組織在裂解前必須研磨，這一過程會導(dǎo)致DNA有損失和降解，另外，還易受人為因素影響，如研磨不夠充分等；三是在研磨尾鰭、鰓蓋等組織時，需要加石英砂，但石英砂可能會阻塞濾紙的濾孔而影響到細(xì)胞內(nèi)容物的過濾[9-13]。因此，為了獲得更好的試驗(yàn)效果，在試驗(yàn)前需進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，建立石英砂、細(xì)胞裂解液、蛋白酶K溶液的不同質(zhì)量或濃度梯度，以確定最適用量。

4 參考文獻(xiàn)

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