不同方法提取天竺葵活性成分及抑菌分析

謝剛剛+閆樹剛+徐鑫+王瑩+許夢(mèng)婷+魏朝俊

摘要 以植物為原料，經(jīng)化學(xué)提取獲取功能活性成分成為一大研究領(lǐng)域。本試驗(yàn)以香葉天竺葵為研究對(duì)象，采用4種提取方法進(jìn)行生物活性物質(zhì)提取。結(jié)果表明，乙醚浸提和乙醇浸提相比，乙醚提取率遠(yuǎn)高于乙醇提取率；索氏提取與乙醇浸泡相比，索氏提取的提取率高于乙醇浸泡的提取率；超聲波輔助提取法（乙醇作溶劑）與乙醇浸泡相比，提取效率相當(dāng)，超聲波輔助提取的提取時(shí)間遠(yuǎn)小于乙醇浸提。將4種提取方法所得提取物分別配制成濃度為2、4、6 mg/mL的丙酮溶液，進(jìn)行桃褐腐菌的抑菌試驗(yàn)分析。結(jié)果顯示，4種提取方法所得提取物均對(duì)桃褐腐菌的生長(zhǎng)繁殖有抑制效果，且抑菌效果隨濃度的增大而增強(qiáng)。6 mg/mL時(shí)，乙醚提取物的抑菌率高達(dá)50.3%，乙醇提取物的抑菌率在31.3%～37.3%之間。

關(guān)鍵詞 香葉天竺葵；提取方法；桃褐腐菌；抑菌率

中圖分類號(hào) S482.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）01-0108-03

Active Components Extracted by Different Methods from Pelargonium graveolensand and Antibacterial Analysis

XIE Gang-gang 1 YAN Shu-gang 2 XU Xin 1 WANG Ying 1 XU Meng-ting 1 WEI Chao-jun 1，2 *

（1 Key Laboratory of Urban Agriculture （North China），Ministry of Agriculture，Beijing 102206；2 Beijing University of Agriculture）

Abstract Obtaining functional active components by chemical extraction from plant has become a major research field. In this experiment，bioactive substances were extracted by four methods from Pelargonium graveolens.The results showed that the extraction rate of ether was much higher than that of ethanol with conventional solvent extract；the soxhlet extraction rate was higher than the conventional solvent extraction rate using ethanol；the ultrasonic-assisted extraction rate was equal with the conventional solvent extraction rate using ethanol，but the extraction time of the ultrasonic-assisted extraction was much shorter than the conventional solvent extraction.The bacteriostasis experiments of extracts from four extraction methods were carried out on monilina fructicola with the concentration of 2 mg/mL，4 mg/mL，and 6 mg/mL in acetone.The results showed that the extracts obtained by the four methods had inhibitory effects on the growth and reproduction of monilina fructicola，the inhibitory effect increased with the increase of concentration.When the concentration was 6 mg/mL，the inhibitory rate of bioactive substances extracted by ether was 50.3%，and the inhibitory rate of bioactive substances extracted by ethanol was 31.3%-37.3%.

Key words Pelargonium graveolens；extraction method；monilina fructicola；inhibitory rate

香葉天竺葵（Pelargonium gravelens L.）是牻牛兒苗科（Ge-raniaceae）天竺葵屬（Pelargonium L. Herit）多年生草本或灌木。天竺葵提取物早期研究集中于對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用[1-3]，隨著研究的深入，其對(duì)細(xì)菌和真菌的抑制作用漸漸被人們發(fā)掘出來。1994年，Chandravadana等[4]用天竺葵提取物（250 mg/kg）對(duì)引起水果炭疽病的真菌進(jìn)行抑菌研究，抑菌率達(dá)60%；1996年，Pattnaik對(duì)香葉天竺葵提取所得精油進(jìn)行抗菌試驗(yàn)，同樣具有良好效果；2000年，Dorman等[5]用25種細(xì)菌進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)天竺葵提取物對(duì)其中的16種菌均有抑制作用；2009年，Rosato等[6]報(bào)道，在體外環(huán)境下，天竺葵和牛至有協(xié)同抑制念珠菌的作用；2012年，彭 云等[7]研究表明，天竺葵提取物對(duì)黃瓜蔓枯病菌的抑制效果很明顯，且隨濃度的增大抑制效果增強(qiáng)；2013年，吳建挺等[8]測(cè)定了天竺葵精油對(duì)6種植物病原真菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)在2 g/L的濃度下，天竺葵精油對(duì)6種植物病原真菌完全抑制。由此可見，天竺葵提取物對(duì)致病性和非致病性細(xì)菌有廣譜殺菌和抑菌作用。

天竺葵提取物的提取方法有很多種。陳 鵬等[9]以乙醇為溶劑，采用靜態(tài)提取法提取天竺葵中有效活性成分；王巨媛等[10]以乙醚為溶劑，采用索氏提取法萃取天竺葵鮮樣的揮發(fā)性成分；李大紅等[11]和鄭青荷等[12]采用水蒸餾法提取獲得天竺葵精油；除了傳統(tǒng)方法之外，石若夫等[13]采用微波輻照誘導(dǎo)萃取天竺葵揮發(fā)油。

桃的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富且味美，是人們喜食的大宗果品之一。桃樹是種植面積和產(chǎn)量?jī)H次于蘋果的核果類果樹[1]，種質(zhì)資源豐富，栽培分布廣泛。北方桃園在多雨季節(jié)易廣泛發(fā)生桃褐腐病。桃褐腐病是由子囊菌鏈核盤菌侵染造成的，尤其集中在果樹開花和成熟時(shí)期，嚴(yán)重影響桃、李、杏、櫻桃和蘋果等核果類果樹?；瘜W(xué)防御是當(dāng)前防治桃褐腐病的主要手段，然而農(nóng)藥化學(xué)品的投入使用也會(huì)帶來品質(zhì)問題和生態(tài)環(huán)境問題。以植物為原料，經(jīng)化學(xué)提取和分離，濃縮某一種或多種有效成分，獲取具備抑菌殺菌活性的植物源農(nóng)藥備受青睞，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展越來越快，成為獨(dú)立新興行業(yè)。

本研究采用乙醇浸提、乙醚浸提、索氏提?。ㄒ掖甲魅軇⒊暡ㄝo助提?。ㄒ掖甲魅軇?種方法對(duì)天竺葵進(jìn)行生物活性物質(zhì)提取，同時(shí)對(duì)4種提取方法得到的提取物進(jìn)行桃褐腐菌的抑菌試驗(yàn)?，F(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料。新鮮盆栽香葉天竺葵（圖1），用剪刀剪下其莖葉，均勻置于合適大小的搪瓷盤中，置于電熱鼓風(fēng)干燥箱，70 ℃ 殺青，用粉碎機(jī)粉碎至粉末狀（圖2）。

1.1.2 試劑耗材。95%乙醇、丙酮、無水乙醚、葡萄糖、瓊脂均為分析純（北京化工廠）；碘量瓶、圓底燒瓶、量筒、燒杯、培養(yǎng)皿等購(gòu)置于北京玻璃廠，去離子水清洗后備用；其他所用槍頭、針頭式細(xì)菌濾器等由供應(yīng)商提供。

1.1.3 儀器。無菌超凈操作臺(tái)（SW-CJ-1FD）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（VV3000）、粉碎機(jī)（JP-300A）、超聲波發(fā)生器（KQ-600）、生化培養(yǎng)箱（LRMIN-70）、分析天平（CP-225D）、電子天平（EPS-502）、全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋（MLS-375）、移液槍（Eppendorf）、索氏提取裝置。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 天竺葵提取方法。①乙醇浸提。準(zhǔn)確稱取10 g天竺葵粉末，置于250 mL碘量瓶中，加入200 mL 95%乙醇，室溫浸泡240 min。抽濾，50 ℃ 旋蒸，蒸干后稱重，3次重復(fù)。②乙醚浸提。準(zhǔn)確稱取10 g天竺葵粉末，置于250 mL碘量瓶中，加入無水乙醚200 mL，常溫浸泡240 min。抽濾，低溫旋蒸，蒸干后稱重，3次重復(fù)。③索氏提取。準(zhǔn)確稱取10 g天竺葵粉末，濾紙包裹致密，置于索氏提取器中，量取 200 mL 95%乙醇置于索氏提取器中，加熱回流一段時(shí)間后停止，50 ℃旋蒸，蒸干后稱重，3次重復(fù)。④超聲波提取。準(zhǔn)確稱取10 g天竺葵粉末，置于250 mL碘量瓶中，加入200 mL 95%乙醇，超聲20 min。抽濾，50 ℃旋蒸，蒸干后稱重，3次重復(fù)。

1.2.2 抑菌試驗(yàn)。①PDA培養(yǎng)基的制備。取去皮土豆200 g，切成1 cm3小塊，加1 L純凈水煮15 min左右（用玻璃棒稍用力即可插穿土豆塊為止），用4層紗布過濾，濾液中加入20 g葡萄糖和10 g瓊脂攪拌定容至1000 mL，分裝入4個(gè)250 mL錐形瓶，封口膜封口，高溫滅菌鍋中滅菌30 min（滅菌鍋溫度121 ℃）。②含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿制作。在超凈工作臺(tái)中，將滅菌后的PDA培養(yǎng)基加入到滅菌后的培養(yǎng)皿中，加入量控制在培養(yǎng)皿高度的1/3～1/2之間。常溫放置，等待180 min。③采用菌絲生長(zhǎng)法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。用丙酮將4種提取方法所得提取物分別稀釋成2、4、6 mg/mL丙酮溶液，用0.22 μL針頭式細(xì)菌濾器過濾溶液，后取0.5 mL加到直徑90 mm含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，等待片刻，使其均勻。將5 mm菌餅（從選擇事先培養(yǎng)好的菌落生長(zhǎng)均勻的培養(yǎng)皿中，沿其邊緣用打孔器打出5 mm菌餅）接種于培養(yǎng)基中心。對(duì)照組加0.5 mL丙酮。對(duì)照組和各試驗(yàn)組均設(shè)5個(gè)平行，37 ℃ 培養(yǎng)2～3 d，待對(duì)照組快要長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)結(jié)束試驗(yàn)，每組挑選生長(zhǎng)情況相似的3個(gè)平行，用厘米刻度尺測(cè)量對(duì)照組和試驗(yàn)組的菌落直徑，計(jì)算其取平均值，并計(jì)算抑制率。

計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑的浸提率比較

由表1可知，乙醚提取率遠(yuǎn)高于乙醇提取率。乙醚作溶劑，通常對(duì)植物中的萜烯類、醛酮類物質(zhì)進(jìn)行提取；乙醇作溶劑，通常對(duì)植物中酚類、甾體類物質(zhì)進(jìn)行提取。天竺葵中含有較多的萜烯類、醛酮類物質(zhì)成分，故乙醚浸提獲得的提取物較多，與文獻(xiàn)結(jié)果一致。

2.2 相同溶劑不同提取方式的效果比較

由表2可知，以乙醇作溶劑，索氏提取的提取率高于超聲波提取，靜態(tài)提取的提取率與超聲波提取相當(dāng)。可見，化合物提取具有一定的飽和性，達(dá)到飽和時(shí)，不能再提取更多的物質(zhì)，而索氏抽提法利用溶劑回流和虹吸原理，使提取物質(zhì)每一次都能為純?nèi)軇┧腿?，從而富集到燒瓶?jī)?nèi)，故提取效率較高。

由圖3可知，乙醇作溶劑，靜態(tài)浸提、索氏提取、超聲波提取的提取效率分別為0.17、0.98、1.98 g/h，說明超聲波輔助提取技術(shù)與常規(guī)溶劑提取法相比有利于植物中有效成分的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)提取的進(jìn)行，強(qiáng)化萃取效果，減少萃取時(shí)間。

2.3 抑菌試驗(yàn)

由表3可知，4種提取方法所得提取物均對(duì)桃褐腐菌的生長(zhǎng)繁殖有抑制效果，且抑菌效果隨濃度的增大而增強(qiáng)。6 mg/mL時(shí)，乙醚提取物的抑菌率高達(dá)50.3%，乙醇提取物的抑菌率在31.3%～37.3%之間。由圖4可知，乙醚浸提所得提取物抑菌效果超過各種乙醇提取物的抑菌效果，說明天竺葵中具有抑菌活性的萜烯類、醛酮類物質(zhì)極性小，易溶于極性較小的乙醚，與文獻(xiàn)結(jié)果一致。超聲波輔助提取法所得提取物抑菌效果差，可能與超聲作用破壞部分物質(zhì)有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

以香葉天竺葵為研究對(duì)象，對(duì)乙醇浸提、乙醚浸提、索氏提?。ㄒ掖甲魅軇⒊暡ㄝo助提?。ㄒ掖甲魅軇?種方法提取生物活性物質(zhì)的提取率和提取時(shí)間進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，乙醚浸提的提取率為20.4%、索氏提?。ㄒ掖甲鋈軇┑奶崛÷蕿?4.7%、乙醇浸提的提取率為6.7%、超聲波輔助提?。ㄒ掖甲鋈軇┑奶崛÷蕿?.6%。乙醚浸提和乙醇浸提相比，乙醚提取率遠(yuǎn)高于乙醇提取率；索氏提取與乙醇浸泡相比，索氏提取的提取率高于乙醇浸泡的提取率；超聲波輔助提取法（乙醇作溶劑）與乙醇浸泡相比，提取效率相當(dāng)時(shí)，但超聲波輔助提取的提取時(shí)間遠(yuǎn)小于乙醇浸提。

抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，4種提取方法所得提取物均對(duì)桃褐腐菌的生長(zhǎng)繁殖有抑制效果，且6 mg/mL時(shí)，乙醚浸提的抑菌率高達(dá)50.3%，比乙醇浸提提高13個(gè)百分點(diǎn)、比索氏提取高16.1個(gè)百分點(diǎn)、比超聲波輔助提取高19個(gè)百分點(diǎn)。

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