磷脂酶Cβ1上調表達與肝細胞肝癌增殖和預后相關

褚 亞， 周 石， 王黎洲， 安天志， 蔣天鵬， 宋 杰， 李 興

肝細胞肝癌（HCC）是全球癌癥相關死亡的主要原因之一，其發(fā)病率呈逐年增長趨勢［1-3］。近期研究發(fā)現(xiàn)癌基因與癌基因激活途徑對肝癌發(fā)生、發(fā)展有重要作用［4］。 磷脂酶 Cβ1（PLCβ1）由位于染色體20p12的PLCβ1基因編碼而成，作為最初G蛋白偶聯(lián)受體與PLCβ異構體偶聯(lián)，催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）形成 1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）、二酰甘油（DAG）［5］并在細胞信號轉導中起重要作用，該通路調節(jié)異常往往加快腫瘤發(fā)展［6］。Gα蛋白激活PLCβ1導致細胞內鈣離子增加，最終引起細胞異常增殖［7］。PLCβ1參與多種疾病發(fā)展過程，精神分裂癥患者大腦中能檢測其異常表達［8］。小鼠PLCβ1基因剔除后表現(xiàn)出與精神分裂癥相關認知行為［9］。作為成肌細胞分化關鍵調節(jié)因子，PLCβ1對強直性肌營養(yǎng)不良的骨骼肌分化有促進作用［10］。PLCβ1能減少細胞氧化應激損傷和防止α-突觸核蛋白聚集［11］，表明擴增其基因能促進K562細胞生長和防止細胞凋亡［12-13］。 此外，PLCβ1陽性靶向細胞周期蛋白 D3并通過蛋白激酶Cα介導途徑調節(jié)細胞周期和細胞增殖［14］。 PLCβ1過表達使 Swiss 3T3細胞進入細胞周期 S 期［15］。致癌過程中 PLCβ1 水平也有所提高［16］。Molinari等［17］證實乳腺癌中 PLCβ1基因拷貝數(shù)發(fā)生改變，乳腺癌組織學分級和增殖指數(shù)與PLCβ1過表達有關。為了解PLCβ1對HCC細胞增殖及預后的影響，本研究探討PLCβ1表達能否促進HCC細胞生長和遷移，刪除或抑制PLCβ1能否延緩其增殖，從而為預防和治療HCC提供新靶標。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

HEK293T細胞，LO2人肝細胞株，人肝癌細胞株HepG2、Hep3B、LM3、Huh7、H7402（美國菌種保藏中心ATCC），均置入含10%胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM，美國Gibco公司），并置于含5%CO2、37℃95%空氣加濕孵化器中培養(yǎng)。

1.2 免疫組織化學染色檢測

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過，肝癌標本由醫(yī)院病理科提供，均經(jīng)病理證實為HCC。采用組織芯片（tissuemicroarrays，TMA）技術，分別將芯片載入 51 例（TMA1）、90 例（TMA2）HCC 患者腫瘤及癌旁組織（上海芯超生物科技公司），二甲苯脫蠟與乙醇脫水復水，于檸檬酸和內源性過氧化物酶緩沖液中作抗原回收，再用10%山羊血清清洗，減少TMA非特異性染色；4℃下孵育抗 PLCβ1抗體（1∶200，sc-205，美國Santa Cruz生物技術公司）；磷酸緩沖液（PBS）洗滌后，用辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗30min，再次PBS洗滌；用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精-伊紅（HE）復染。采用半定量評分系統(tǒng)評價染色片強度（0、1、2、3）和陽性百分比，兩分數(shù)相乘計算最終得分，分為低表達組和高表達組。

1.3 實時定量聚合酶鏈反應檢測

采用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）分離細胞總RNA，PrimeScriptTM逆轉錄-聚合酶鏈反應（RTPCR）試劑盒（日本 TaKaRa公司）合成 cDNA第 1鏈，SYBR Green染色7500序列（美國ABI公司）檢測PLCβ1 mRNA表達水平，β-肌動蛋白作為內部對照。人PLCβ1基因擴增引物：正向引物為5’-GATGAGCCCAGATGGCCG-3’， 反向引物為 5’-AGTTGAGTCATCATCCCACTTGA-3’。 β-肌動蛋白引物：正向引物為5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’， 反向引物為 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。

1.4 蛋白印跡檢測

采用抗磷酸化細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2（4376#）、抗 ERK1/2（9102#）（美國 CST 公司）、抗-雙特異性磷酸酶（DUSP）1（sc-370）、抗 β-肌動蛋白（sc-47778）（美國 Santa Cruz生物技術公司）檢測PLCβ1印跡。將細胞置于含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合物的放射免疫沉淀試驗（RIPA）緩沖液（美國Sigma公司）裂解，二辛可酸（BCA）法測定總蛋白濃度，將60μg總蛋白于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）下分離，分離蛋白移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國Millipore公司）并用無脂牛奶封膜，一抗孵育過夜；Tris緩沖0.9%NaCl液（TBST）洗滌后，將膜與HRP標記的二抗一起孵育，增強型化學發(fā)光（ECL）顯色。

1.5 PLCβ1過表達構建與RNAi介導PLCβ1敲除

慢病毒載體pLK0.1-TRC克隆PLCβ1 cDNA。psPAX2和pMD2G質粒構建重組慢病毒細胞系，以便穩(wěn)定地過表達PLCβ1；shRNA有限擾碼序列編碼PLCβ1作為對照組。

1.6 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7活性檢測

將細胞接種至96孔板（2×103細胞/孔）。采用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8，日本Dojindo公司）分別于24、48、72、96 h 評估細胞活力，450 nm 處測定其吸光度。72 h時清除血清，檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3/7活性。實驗至少重復3次。

1.7 集落形成檢測

將細胞接種至 6孔板（2×104細胞/孔）并培養(yǎng)10 d，指定時間點用PBS洗滌細胞2次，結晶紫處理10min后洗滌，然后計數(shù)、檢測。實驗至少重復3次。

1.8 腫瘤治療

141例HCC患者均接受外科手術切除，術后常規(guī)每 1、3、6、12 個月門診隨訪甲胎蛋白（AFP），腹部增強CT和/或MRI；12個月后每半年隨訪1次。若患者影像學表現(xiàn)提示腫瘤復發(fā)和/或AFP增高，則每隔1～3個月予介入灌注化療栓塞及射頻消融等綜合治療。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件和GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計血分析和圖形顯示。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，卡方檢驗分析臨床特征與PLCβ1表達的關系，t檢驗評估體外研究，Kaplan-Meier法評估總生存期（OS），單因素和多因素風險比分析用Cox回歸模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PLCβ1表達與HCC預后關系

免疫組織化學染色檢測顯示，TMA1、TMA2細胞核和細胞質中檢測到PLCβ1蛋白，結果發(fā)現(xiàn)HCC組織中PLCβ1表達比癌旁組織明顯增高（圖1）。141例HCC標本中80例標本檢測顯示PLCβ1呈高表達，PLCβ1表達與巴塞羅那臨床肝癌（BCLC）分期密切相關（P＝0.014 5），與其它參數(shù)和特征無顯著相關（表1）；Kaplan-MeierK曲線與OS分析顯示，PLCβ1高表達患者比低表達患者生存率低，平均生存時間明顯縮短（P＝0.001）（圖 2），表明 PLCβ1 表達與OS顯著相關；Cox回歸單因素分析顯示OS與腫瘤大小、BCLC分期、PLCβ1表達有關，多因素分析表明PLCβ1顯著表達是與HCC患者OS明顯相關的獨立預后因素（表2）。

2.2 PLCB1對HCC細胞增殖和凋亡的影響

圖1 PLCβ1在HCC組織中過表達

表1 PLCβ1表達與HCC患者臨床參數(shù)相關性 n

圖2 141例HCC患者Kaplan-Meier分析

表2 Cox回歸分析141例HCC患者OS結果

RT-PCR和蛋白印跡檢測結果表明，人肝癌細胞系中PLCβ1對應mRNA和蛋白（圖3）水平表達均比LO2人肝細胞系高。蛋白印跡檢測證實慢病毒載體構建了穩(wěn)定過表達PLCβ1的HepG2和Huh7細胞（圖4①），CCK-8檢測結果表明PLCβ1過表達的HepG2和Huh7細胞活力比對照細胞明顯增高（圖4②），集落形成檢測和結晶紫染色顯示PLCβ1過表達細胞生長能力比對照細胞增強（圖4③），細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)PLCβ1過表達細胞caspase-3/7活性顯著降低（圖4④）；表明PLCβ1過度表達可促進PLCβ1細胞生長并抑制其凋亡。慢病毒遞送shRNA（SH-1和SH-2）降低PLCβ1內源性表達實驗顯示，Hep3B和LM3細胞shRNA表達PLCβ1比SH-1和SH-2增強（圖5①），體外細胞存活率和集落形成檢測顯示PLCβ1低表達的SH-1和SH-2細胞增殖抑制明顯（圖5②③），SH-1和SH-2細胞caspase-3/7活性比對照（shCON）細胞增高（圖5④）；表明下調PLCβ1能抑制PLCβ1細胞惡性表達。

2.3 PLCβ1致癌性與ERK活化關系

蛋白印跡檢測ERK激活狀態(tài)表明，PLCβ1高表達的HepG2和Huh7細胞顯著刺激ERK1/2細胞轉導通路磷酸化，而降低PLCβ1表達的Hep3B細胞有效下調ERK1/2通路磷酸化水平（圖6①②），集落形成檢測顯示ERK抑制劑U0126可抑制PLCβ1對HCC細胞生長的促進作用（圖6③），DUSP1表達均無明顯變化；表明PLCβ1可調節(jié)激活HCC細胞ERK信號轉導通路，從而促進致癌活性。

3 討論

癌基因激活與關鍵轉導通路異常激活通常是非腫瘤細胞瘤變必不可少的環(huán)節(jié)［18-19］。本研究表明，PLCβ1過表達能促進細胞生長，反之抑制生長；ERK信號通路異常激活可能與PLCβ1有關；PLCβ1表達升高可能與HCC進展呈正相關。因此，PLCβ1可能作為一種新的HCC獨立預后因素。

圖3 PLCβ1在LO2人肝細胞系和人肝癌細胞系中表達

圖4 PLCβ1過表達對HepG2和Huh7細胞增殖和凋亡的影響

圖5 PLCβ1低表達對Hep3B和LM3細胞增殖和凋亡的影響

圖6 ERK對PLCβ1致癌活性的影響

細胞外信息傳遞可刺激細胞內部轉導通路激活。PLCβ1可編碼磷脂酰肌醇特異酶，激活G蛋白并催化其形成第2信使，啟動進一步細胞內信號轉導［20］。有研究表明PLCβ1在調節(jié)疾病各種功能方面起重要作用［11-21］。小鼠模型中PLCβ1低表達可能誘發(fā)癲癇［7］。 Hela 細胞中 PLCβ1 參與 IP3 生成［22］。 乳腺癌組織學分級和增殖指數(shù)與PLCβ1密切相關，PLCβ1 低表達患者預后相對較好［17］。

既往研究發(fā)現(xiàn)，位于染色體8q和20的某個基因可作為肝母細胞瘤預后不良的預測因素［23］。PLCβ1基因位于染色體20p12，其上調情況受到關注。但迄今尚未見PLCβ1表達與HCC間關聯(lián)相關報道。本研究結果表明PLCβ1與肝癌BCLC分期有相關性，與腫瘤大小、是否伴發(fā)肝硬化等無明顯相關，但腫瘤發(fā)生涉及復雜機制；PLCβ1可能作為一種生物標志物，明確HCC表型；PLCβ1高表達患者表現(xiàn)出較低OS。多因素分析表明PLCβ1表達是HCC獨立預后因素。

PLCβ1促進肝癌進展機制尚不明確。本研究體外實驗表明PLCβ1過表達促進肝癌細胞增殖并抑制其凋亡，并激活已證明能影響細胞生長和凋亡的ERK信號轉導通路。ERK激活是通過調節(jié)DUSP去磷酸化實現(xiàn)的［24］。PLCβ1改變引起DUSP1表達變化，提示ERK激活。此外，胰島素樣生長因子（IGF）-Ⅰ可能引起細胞核ERK活化，同時誘導細胞核PLCβ1磷酸化，啟動磷酸肌醇循環(huán)［25］，這可能是PLCβ1與ERK信號通路之間調節(jié)環(huán)路。近年抑制ERK激酶活性化合物研究已取得部分前期臨床結果，在癌癥治療中取得一些進展［26］。本研究發(fā)現(xiàn)PLCβ1過表達介導的部分細胞增殖效應，可被ERK抑制劑阻斷。

總之，本研究由肝癌發(fā)生發(fā)展中的臨床標本和體外實驗結果驗證，HCC患者PLCβ1過表達可能在促進腫瘤發(fā)生中起重要作用，且與侵襲性行為密切相關，可作為HCC預后的一個預測指標；抑制PLCβ1介導的信號通路可能會控制HCC進展，PLCβ1可能是今后肝癌治療的潛在分子靶點。

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