離子液體與重組工程菌的生物相容性研究及在手性合成中的應(yīng)用

樊淼 ，張溶津，劉 琤，李 軍

（杭州醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053）

隨著非水酶學(xué)的發(fā)展，生物催化技術(shù)已廣泛用于合成手性藥物[1-3]。由于水相催化出現(xiàn)諸如水難溶底物溶解性差，底/產(chǎn)物的細(xì)胞毒性等問(wèn)題，制約著生物合成領(lǐng)域的發(fā)展[4-6]。近年來(lái)，作為環(huán)境友好的綠色溶劑，離子液體為生物催化反應(yīng)提供了不同于水相和傳統(tǒng)有機(jī)溶劑的介質(zhì)環(huán)境，因其獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)使基于離子液體介質(zhì)生物催化成為近年來(lái)醫(yī)藥化工的研究熱點(diǎn)之一[7-8]。離子液體種類(lèi)較多，但適于構(gòu)建生物合成手性藥物反應(yīng)體系的離子液體種類(lèi)較少，而離子液體的生物相容性研究是開(kāi)發(fā)適于生物催化離子液體的關(guān)鍵。研究表明，部分離子液體對(duì)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，影響細(xì)胞代謝及細(xì)胞膜完整性，因此離子液體生物相容性研究十分必要[9-12]。采用離子液體構(gòu)建生物合成反應(yīng)體系時(shí)，應(yīng)考慮離子液體的生物相容性，研究離子液體對(duì)細(xì)胞的毒性、細(xì)胞存活率及代謝活性等因素。通過(guò)不同種類(lèi)離子液體對(duì)微生物細(xì)胞的生物相容性研究，得出離子液體結(jié)構(gòu)與其生物相容性之間的構(gòu)效關(guān)系，從而構(gòu)建高效反應(yīng)體系用于生物合成手性藥物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（SHP-150），立式壓力蒸汽滅菌器（MLS-3750），生物安全柜（HF1200），恒溫?fù)u床（TS-200B），電子天平 （AL204），多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax M2e），安捷倫氣相色譜儀（7820A）。

1.2 主要試劑

E.coli BL21（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建基因重組菌，基因序列ScCR （GenBank Accession No.NC 003888.3）由上海生工合成；葡萄糖測(cè)定試劑盒，4-氯乙酰乙酸乙酯，（R）-3-羥基丁酸乙酯及其它化學(xué)試劑均為市售化學(xué)純、分析純或生化試劑。

1.3 離子液體種類(lèi)

實(shí)驗(yàn)中所用離子液體見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)離子液體種類(lèi)與縮寫(xiě)Table 1 Ionic liquids used in the experiment

1.4 細(xì)胞糖代謝活力測(cè)定

離子液體對(duì)細(xì)胞代謝活性的影響可由菌體細(xì)胞的糖代謝保留值來(lái)表征。細(xì)胞代謝活性保留定義為：經(jīng)離子液體處理后的細(xì)胞糖代謝率與未經(jīng)離子液體處理（即空白對(duì)照）的細(xì)胞糖代謝率的比值。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：0.1 g E.coli BL21（DE3） 菌體懸浮于 20 mL PBS （Na2HPO4/NaH2PO4；pH=6.5）中，再加入適量離子液體，以不加離子液體組為空白對(duì)照，在30℃，200 rpm條件下24 h；取出菌懸液，收集菌體，經(jīng)蒸餾水洗滌后，加入10 g/L葡萄糖水溶液20 mL，繼續(xù)在搖床30℃，200 r/min條件下恒溫保持4 h，8000 rpm離心10 min收集上清液，用葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法測(cè)得殘?zhí)牵源擞?jì)算4 h內(nèi)細(xì)胞的糖代謝率。

1.5 細(xì)胞膜通透性測(cè)定

0.1 g E.coli BL21（DE3）菌體懸浮于含一定量含離子液體的 PBS溶液中（Na2HPO4/NaH2PO4；pH=6.5），以不含離子液體的PBS為對(duì)照，于30℃，200 r/min條件下孵化6 h。8000 r/min離心10 min，收集上清液。檢測(cè)260 nm和280 nm處吸光值以確定樣品中核酸和蛋白質(zhì)的含量，即可得出離子液體對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響。

1.6 E.coli BL21（DE3）催化不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)及氣相色譜分析法

反應(yīng)體系：0.1 g E.coli BL21（DE3）菌體于250 mL搖瓶中，并在 20 mL PBS（Na2HPO4/NaH2PO4；pH=6.5）中懸浮細(xì)胞，加入 20% （v/v）異丙醇，添加4-氯乙酰乙酸乙酯底物，構(gòu)建含離子液體介質(zhì)體系時(shí)，親水性離子液體添加量為5%（v/v）， 疏水性離子液體添加量為 15% （v/v），于30℃、200 r/min的搖床中反應(yīng)24 h。

氣相色譜分析方法：底物和產(chǎn)物檢測(cè)采用氣相色譜法。氣相色譜條件：安捷倫GC-7820A氣相色譜儀，色譜柱為Varian CP-Chirasil-Dex手性毛細(xì)管氣相色譜柱 （25 m×0.25 mm×0.25 μm， df=0.25）。載氣為氮?dú)?，流量?.0 mL/min；色譜柱溫度90℃ ～150℃；升溫速度：10℃/min；檢測(cè)器和進(jìn)樣口溫度均為250℃，檢測(cè)器為FID；進(jìn)樣量1 μL，分流比為 20 ∶1。

2 結(jié)果與討論

2.1 親水性離子液體對(duì)E.coli BL21（DE3）糖代謝能力影響

圖1 親水性離子液體對(duì)E.coli BL21（DE3）糖代謝能力的影響Fig.1 Effect of hydrophilic ILs on sugar metabolic activity retention （MAR） of E.coli BL21（DE3）

離子液體由于其不易揮發(fā)、溶解能力強(qiáng)等特性，通常被認(rèn)為是綠色溶劑，而不同離子液體對(duì)生物催化劑的毒性不同。首先研究咪唑、吡啶等八種親水性離子液體對(duì)重組基因工程菌E.coli BL21（DE3）細(xì)胞糖代謝活力的影響，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)離子液體的陰離子相同時(shí)，離子液體陽(yáng)離子對(duì)細(xì)胞的毒性順序?yàn)椋篬N2，2，2，2]+＜ [Epy]+＜[EMMP]+＜ [P1，2]+＜ [EMIM]+＜ [PP1，4]+＜ [DMIM]+＜[BMIM]+。以上研究結(jié)果表明，八種親水性離子液體對(duì)E.coli BL21（DE3）細(xì)胞均有毒性，其中季銨型離子液體[N2，2，2，2][BF4]對(duì)細(xì)胞糖代謝能力影響最小，其次是吡啶類(lèi)和嗎啉類(lèi)離子液體。

2.2 親水性離子液體對(duì)E.coli BL21（DE3）細(xì)胞膜通透性影響

離子液體可改善細(xì)胞膜的通透性，在反應(yīng)體系中添加離子液體可提高底/產(chǎn)物發(fā)生酶促反應(yīng)速率，并減少底/產(chǎn)物抑制。離子液體對(duì)細(xì)胞膜通透性影響研究結(jié)果如圖2所示，八種離子液體均可增加細(xì)胞膜通透性，但也增加了細(xì)胞死亡率。與對(duì)照相比，含[N2，2，2，2][BF4]體系可適度增加細(xì)胞膜通透性，且季銨鹽離子液體的細(xì)胞糖代謝能力較佳。 因此，[N2，2，2，2][BF4]被認(rèn)為是生物相容性較好的反應(yīng)體系可用于生物合成。

表2 親水性離子液體對(duì)細(xì)胞膜透性的影響Table 2 Effect of various hydrophilic ionic liquids on cell membrane permeability

2.3 親水性離子液體對(duì)E.coli BL21（DE3）催化還原反應(yīng)影響

生物相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，季銨鹽離子液體[N2，2，2，2][BF4]對(duì) E.coli BL21 （DE3） 細(xì)胞具有較好的生物相容性。含該離子液體介質(zhì)中E.coli BL21（DE3）生物不對(duì)稱(chēng)催化還原制備（R）-3-羥基丁酸乙酯反應(yīng)效率如表3所示。與對(duì)照相比，含[N2，2，2，2][BF4]、[PP1，4][BF4]、[EMIM][BF4]離子液體介質(zhì)反應(yīng)體系可有效提高生物催化產(chǎn)率，基于不同離子液體介質(zhì)中E.coli BL21（DE3）催化效率如下：[N2，2，2，2][BF4]＞ [PP1，4][BF4]＞ [EMIM][BF4]＞[EMMP][BF4]＞[BMIM][BF4]＞[Epy][BF4]＞[DMIM][BF4]＞ [P1，2][BF4]。以上研究結(jié)果表明，親水性離子液體的生物相容性規(guī)律與催化效率不完全一致，但生物相容性最好的季銨型離子液體[N2，2，2，2][BF4]的催化效率最高，達(dá) 97.1%，ee 值為99%。

表3 親水性離子液體對(duì)生物不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)的影響Table 3 Effect of various hydrophilic ILs on the biocatalytic reaction

2.4 疏水性離子液體對(duì)E.coli BL21（DE3）細(xì)胞糖代謝活力影響

圖2 疏水性離子液體對(duì)E.coli BL21（DE3）糖代謝能力影響Fig.2 Effect of hydrophobic ILs on MAR of E.coli BL21（DE3）

由于反應(yīng)底物多為水難溶性化合物，而疏水性離子液體可增加底物在反應(yīng)體系中的溶解性。因此，研究不同種類(lèi)疏水性離子液體對(duì)E.coli BL21（DE3）糖代謝活力影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)離子液體的陰離子相同時(shí)，離子液體陽(yáng)離子對(duì)細(xì)胞的毒性順序?yàn)椋篬N2，2，2，2]+＜ [Epy]+＜ [EMMP]+＜ [P1，2]+＜ [EMIM]+＜ [PP1，4]+＜ [DMIM]+＜[BMIM]+。結(jié)果與親水性離子液體對(duì)E.coli BL21（DE3）糖代謝活力影響規(guī)律一致，季銨型離子液體的生物相容性最好。

2.5 疏水性離子液體對(duì)E.coli BL21（DE3）細(xì)胞膜通透性影響

不同疏水性離子液體對(duì)細(xì)胞膜通透性影響結(jié)果如表4所示，與親水性離子液體相比，疏水性離子液體更能增加細(xì)胞膜通透性，但細(xì)胞毒性隨之增加，尤其以咪唑類(lèi)離子液體毒性最大，其可能已導(dǎo)致細(xì)胞死亡。與對(duì)照相比，[N2，2，2，2][PF6]與親水性離子液體[N2，2，2，2][BF4]一樣，可適度增加細(xì)胞膜通透性，增加底物發(fā)生酶促反應(yīng)效率。

表4 疏水性離子液體對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響Table 4 Effect of various hydrophobic ILs on cell membrane permeability

2.6 疏水性離子液體對(duì)E.coli BL21（DE3）催化反應(yīng)影響

疏水性離子液體可通過(guò)增加水難溶性底物的溶解性提高生物合成效率，結(jié)果如表5所示。與對(duì)照相比， 體系中添加 [PP1，4][PF6]和[N2，2，2，2][PF6]兩種離子液體可提高不對(duì)稱(chēng)還原效率。 且當(dāng)體系中添加[N2，2，2，2][PF6]后，產(chǎn)物產(chǎn)率達(dá)最高，表現(xiàn)出較好的催化性能。所有離子液體對(duì)手性化合物ee值無(wú)影響。

3 結(jié)論

通過(guò)細(xì)胞糖代謝能力和細(xì)胞膜通透性研究了不同離子液體與重組工程菌E.coli BL21（DE3）的生物相容性，并構(gòu)建基于離子液體介質(zhì)生物催化不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)體系，并研究其催化性能。研究結(jié)果表明季胺型離子液體[N2，2，2，2][BF4]是生物相容性最好的溶劑，且催化性能最佳。通過(guò)對(duì)離子液體的生物相容性研究，為構(gòu)建高效生物合成手性藥物反應(yīng)體系提供參考，從而推動(dòng)手性藥物高效合成新技術(shù)快速發(fā)展。

表5 疏水性離子液體對(duì)E.coli BL21（DE3）催化反應(yīng)的影響Table 5 Effect of various hydrophobic ILs on biocatalytic reaction

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