產香酵母發(fā)酵處理煙草花蕾條件優(yōu)化及煙用香料制備研究

許春平+孟丹丹+冉盼盼

摘要：通過正交試驗，利用產香酵母對煙草花蕾進行發(fā)酵優(yōu)化，然后對發(fā)酵產物進行美拉德反應，利用同時蒸餾萃取方法提取香味成分后用GC-MS分析香味成分。結果表明，香味物質主要有63種，其中軟脂酸、肉豆蔻酸、棕櫚油酸、苯甲醇、苯乙醇、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮等香氣濃度大；巨豆三烯酮、二氫獼猴桃內酯、油酸酰胺、2-正戊基呋喃香氣閾值低，是煙草中關鍵的致香物質，對煙草香氣貢獻突出。以香氣總量為指標，35 ℃、pH=5、12 h、6%（V/V）接種量時香氣總量最高，高達760.74 μg/g。以水溶性氨基酸和水溶性還原糖的含量為指標，發(fā)酵處理在35 ℃、pH=5、24 h、5%（V/V）接種量時氨基酸含量和還原糖含量最高，分別為2.860 52、0.151 24 mg/g。香氣含量與氨基酸和還原糖含量的關系不是正相關關系。

關鍵詞：產香酵母發(fā)酵；美拉德反應；煙草花蕾；工藝

中圖分類號：S571.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）01-0100-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.01.026

Abstract： Aroma-producing yeast was used to carry out to optimize the fermentation with tobacco bud by orthogonal design. Maillard reaction was carried out. Then，the aroma components was extracted by simultaneous distillation extraction method， and the aroma components were analyzed by GC-MS. The results showed the aroma components were mainly included 63 kinds，and myristic acid，myristic acid，dihydroactinidiolide，phytone，damascenone，megastigmatrienone，caryophyllene oxide，cembrene，oleic acid amide and 2-pentylfuran with lower odor threshold were the key aroma compounds in tobacco with outstanding contribution to tobacco aroma. Taking the total aroma amount as the index，under the optimal fermentation condition of 35 ℃，pH=5，12 h with 6% inoculating amount， the total aroma amount reached the highest level of 760.74 μg/g. Taking the contents of water-soluble amino acid and water-soluble reducing sugar as the index，under the fermentation condition of 35 ℃，pH=5，24 h with 5% inoculating amount，the contents of amino acid and reducing sugar reached the highest level. The highest amino acid content reached 2.860 52 mg/g，while the highest sugar content could reach 0.151 24 mg/g. The relationship between aroma content and amino acid and reducing sugar contents was not positively correlated.

Key words： aroma producing yeast； maillard reaction； tobacco bud； processing

煙葉發(fā)酵是卷煙加工中重要的環(huán)節(jié)，良好的發(fā)酵工藝可以改善煙葉品質，未經發(fā)酵處理的煙葉不同程度地有多種品質缺陷，生青雜氣和刺激性突出，沒有陳化煙葉的特征香氣，香氣質單調，香氣量不足，不能直接用來生產卷煙。通過發(fā)酵后，煙葉青雜氣和刺激性下降，煙草特征香氣顯露，可用性顯著提高，因此煙葉最好經過發(fā)酵處理用于卷煙[1-3]。根據(jù)發(fā)酵條件和方法的不同，煙草發(fā)酵被分為自然發(fā)酵和人工發(fā)酵，自然發(fā)酵是在庫房室溫條件下將煙葉貯存一段時間，在自然條件下陳化煙葉，使煙葉更符合吸食要求[4-6]。這種發(fā)酵方法被歐美和中國云南普遍采用。人工發(fā)酵是在特定的人工強化溫度和空氣濕度的發(fā)酵室內，加速陳化煙葉，使其更適合吸食要求的發(fā)酵方式。這種方法是20世紀50年代前蘇聯(lián)科學家發(fā)明并在東歐和中國被推廣應用的一種發(fā)酵方法[7]。

近年來，國內外利用微生物增加煙葉香氣的研究，已有報道。朱大恒等[8]報道了以1株產香菌的發(fā)酵產物作為香料可使卷煙品質明顯改善，煙氣醇和而飽滿，能減輕卷煙雜氣和刺激性，并用煙末、豆粕、煙秸桿等作為產香菌的發(fā)酵物，生產香精應用于煙葉發(fā)酵，效果比較明顯。鄭小嘎等[9，10]分析了人工發(fā)酵煙葉增香途徑的研究進展，并利用真菌菌劑處理上部葉烤煙煙絲，處理后煙葉香氣質提高，香氣量增加，刺激性減小，余味舒適，煙葉品質明顯提高。周瑾等[11]發(fā)現(xiàn)菌株u-81能有效地將煙葉中的蛋白質分解為氨基酸，再加外源葡萄糖在一定溫度下發(fā)生反應提升煙葉品質。左天覺等[12]證實煙葉中的煙堿含量不僅與煙草的品種、產地、氣候、施肥等有關，也與后期工藝水平以及微生物的處理有關。本試驗利用產香酵母處理煙草花蕾制備煙用香料，并利用GC-MS對其進行揮發(fā)性成分分析，為進一步研究煙用香料提供參考。endprint

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試材料云煙87煙草花蕾；釀酒高活性酵母；葡萄糖、谷氨酸、磷酸氫二鈉、磷二氫鈉、3，5-二硝基水楊酸鈉、丙二醇、1 mol/L NaOH、1 mol/L H2SO4、二氯甲烷、0.821 1 mg/mL乙酸苯乙酯等。

儀器：Q-100A3型旗箭粉碎機（上海冰都電器有限公司），HS-4型恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠），PL203型電子分析天平（0.000 1 g），RIGOL UItra-3400型紫外分光光度計（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），DGX-9143型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海?，斣O備有限公司），BIORIDGE盧湘儀TGL-16M離心機，蒸餾萃取裝置（鄭州科技玻璃儀器廠），6890/5973型氣相色譜/質譜聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 產香酵母活化方法 將產香酵母用35～40 ℃的水活化15～20 min，然后溫度降至34 ℃以下活化1～2 h。將10 g產香酵母放入250 mL的錐形瓶中，加入100 mL 35～40 ℃的無菌水在32 ℃的水浴鍋中活化2 h，備用。

1.2.2 煙草花蕾滅菌處理方法 將干燥的云煙87煙草花蕾粉碎，過60目篩，置于500 mL錐形瓶中以料液比1∶10的比例加入200 mL去離子水。放入水浴鍋中沸水浴30 min達到滅菌效果。

1.2.3 發(fā)酵條件正交優(yōu)化試驗 采用正交試驗設計，選用L9（34）正交試驗對產香酵母發(fā)酵條件（溫度、發(fā)酵時間、發(fā)酵pH、加菌量）進行了優(yōu)化試驗設計。試驗水平與因素見表1。

1.2.4 DNS法測定還原糖 采用DNS法測定水溶性還原糖：配制3，5-二硝基水楊酸鈉試劑（DNS），將6.5 g的3，5-二硝基水楊酸鈉和2 mol/L NaOH加到500 mL含有182 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g苯酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加去離子水定容至1 000 mL，貯存于棕色瓶中室溫放置7～10 d后標定使用。取1.0 mg/mL葡萄糖標準溶液，按表2加入試劑沸水浴中加熱5 min，冷水冷卻后定容至25 mL搖勻，在520 nm波長測定吸光度。測得還原糖數(shù)據(jù)繪制標準曲線，方程為y=0.418 2x+0.008 7，R2=0.997 3。通過標準曲線及稀釋倍數(shù)計算還原糖含量，計算公式：還原糖含量（mg/g）=（還原糖濃度×稀釋倍數(shù)）/樣品質量。

1.2.5 茚三酮法測定氨基酸 采用茚三酮法測定水溶性氨基酸：茚三酮顯色液，2 g茚三酮加入100 mL去離子水溶解，放入棕色瓶中保存，每次使用前配置；pH 8緩沖液，0.2 mol/L Na2HPO4 94.7 mL與0.2 mol/L NaH2PO4 5.3 mL合并，混勻。取0.2 mg/mL谷氨酸標準溶液按表3加入試劑沸水浴中加熱15 min，冷水冷卻后定容至10 mL搖勻，在570 nm波長下測定吸光度。測得氨基酸數(shù)據(jù)繪制標準曲線，得到方程為y=0.550 9x-0.210 6，R2=0.992 9。通過標準曲線及稀釋倍數(shù)計算氨基酸含量，計算公式：氨基酸含量（mg/g）=（氨基酸濃度×稀釋倍數(shù)）/樣品質量。

1.2.6 美拉德反應處理方法 在酶解試驗后的樣品中各加入20 mL丙二醇，調pH為7（1 mol/L NaOH調至pH=7）用封口膜封口放入烘箱，70 ℃反應12 h[13-15]。

1.2.7 同時蒸餾萃取提取香味物質 將美拉德反應產物倒入同時蒸餾萃取裝置一端的平底燒瓶中，加入100 mL去離子水，用電子調溫電熱套加熱，裝置的另一端蒸餾瓶中注入50 mL二氯甲烷，于60 ℃水浴中加熱。同時蒸餾萃取當水與二氯甲烷分層開始計時2.5 h后萃取結束，在二氯甲烷萃取液中加入含量為0.821 1 mg/mL的乙酸苯乙酯1 mL和無水硫酸鈉若干，靜置過夜。然后于35～40 ℃條件下濃縮。濃縮至約1 mL轉至樣品瓶中，低溫密封保存，用于GC-MS進行定量分析[16]。

1.2.8 GC-MS條件 色譜條件，色譜柱為HP-5MS 色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），進樣口溫度280 ℃，分流比10∶1，進樣量1 μL，載氣為氦氣，載氣流量為3 mL/min，升溫程序為初始溫度50 ℃，以4 ℃/min升至280 ℃。質譜條件，EI源，接口溫度270 ℃，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃。采集模式，掃描[17]，質量掃描范圍35～550 m/z。揮發(fā)性物質含量（μg/g）=（內標物質量×揮發(fā)性物質峰面積×1 000）/（煙草花蕾質量×內標物峰面積）。

2 結果與分析

2.1 香味成分物質分析

利用Nist11譜庫將質譜圖中各色譜峰進行檢索，同時進行人工解析，對化學成分進行定性分析。采用內標法（內標物0.821 1 mg/mL的乙酸苯乙酯）[假定相對校正因子（相對于內標）為1]對物質進行定量，結果見表4。

從表4可以看出，煙草花蕾經產香酵母發(fā)酵美拉德反應加香后，經GC-MS分析后共有香味物質63種，主要包括醇18類、醛9類、酸10類、酯4類、酮10類、稀13類、呋喃、吡啶、吲哚、胺類等，其中軟脂酸、肉豆蔻酸、棕櫚油酸、苯甲醇、苯乙醇、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮等香氣濃度大；巨豆三烯酮、二氫獼猴桃內酯、油酸酰胺、2-正戊基呋喃香氣閾值低，是煙草中關鍵的致香物質，對煙草香氣貢獻突出。

2.2 發(fā)酵條件正交試驗結果

以氨基酸和還原糖含量為指標優(yōu)化發(fā)酵條件，發(fā)酵條件正交試驗每個樣品做3個水平的平行試驗，結果如表5所示。

從表5中可以看出，樣品6的氨基酸含量最高可達到2.860 52 mg/g，樣品8的還原糖含量最高可達到0.151 24 mg/g。樣品1的氨基酸含量最低，樣品5的還原糖含量最低。發(fā)酵處理的較優(yōu)水平為A2B2C2D2，A2′=A3′，B2′=B3′，C1′，D1′，主次因素為A>B>D>C、A′=B′=D′>C′。endprint

香氣總量是樣品4中含量最高，達到760.74 μg/g，樣品8的香氣總量最低，含量為385.30 μg/g，煙草花蕾香氣總量由高到低依次分別是樣品4、樣品7、樣品2、樣品3、樣品1、樣品5、樣品9、樣品6、樣品8。樣品6的氨基酸含量最高，樣品8的還原糖含量最高，但是樣品6、樣品8香氣總量都不是最高，樣品1的氨基酸含量最低，樣品5的還原糖含量最低，但是樣品1、樣品5香氣總量并不是最低。說明香氣含量與氨基酸和還原糖含量的關系不是正相關關系。

3 小結

以煙草花蕾為原料，經產香酵母的發(fā)酵處理，通過正交試驗優(yōu)化發(fā)酵處理條件，然后產香酵母發(fā)酵正交優(yōu)化處理后進行美拉德反應，然后利用同時蒸餾萃取方法提取香味成分，GC-MS分析香味成分，得出發(fā)酵處理后經美拉德反應同時蒸餾萃取提取的香味物質主要有63種，主要包括醇18類、醛9類、酸10類、酯4類、酮10類、稀13類、呋喃、吡啶、吲哚、胺類等，其中軟脂酸、肉豆蔻酸、棕櫚油酸、苯乙醇、三環(huán)稀等香氣濃度大；巨豆三烯酮、二氫獼猴桃內酯、油酸酰胺、2-正戊基呋喃香氣閾值低，是煙草中關鍵的致香物質，對煙草香氣貢獻突出。產香酵母發(fā)酵正交試驗及香氣總量結果可以看出，氨基酸含量最高可達到2.860 52 mg/g，還原糖含量最高可達到0.151 24 mg/g。但是氨基酸還原糖最高時，所對應的香氣總量并非最高，說明香氣含量與氨基酸和還原糖含量的關系不是正相關關系。

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