不同靜水壓力對大鼠髁突軟骨細胞的TRPM7和Fas蛋白表達的影響

陳秋秋+劉海霞+肖朋

[摘要]目的：觀察不同靜水壓力作用下大鼠顳下頜關節(jié)髁突軟骨細胞TRPM7和Fas蛋白的表達情況，探討不同靜水壓力可能對軟骨細胞凋亡的影響。方法：將軟骨細胞隨機分組，分別給予不同大小和時間的壓力刺激。Western Blot檢測每組TRPM7和Fas蛋白量。結果：加壓時間為1h、2h時，6～10kPa實驗組的Fas蛋白量均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05；當壓力值為20kPa/2h、30kPa/1h或2h時，實驗組高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05；當壓力為20kPa/1h時，實驗組高于對照組，差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。加壓時間分別為1h、2h時，6～20kPa實驗組的TRPM7蛋白量均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05；當壓力值為30kPa/2h時，實驗組高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05；但壓力值為30kPa/1h時，實驗組高于對照組，差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。結論：較小壓力范圍內，可能抑制軟骨細胞的凋亡；壓力條件超過一定界限后，可能對軟骨細胞凋亡有促進作用。

[關鍵詞]顳下頜關節(jié)；軟骨細胞；靜水壓力；凋亡

[中圖分類號]R782.6 [文獻標志碼]A

[文章編號]1008-6455（2017）07-0044-04

在顳下頜關節(jié)的一些疾病中，存在以髁突軟骨細胞（mandibular condylar cartilage cells，MCCs）凋亡過度而致軟骨細胞層變薄為特征的退行性變化，可能與關節(jié)內壓異常增大有關。前期研究發(fā)現大鼠應激狀態(tài)下咬肌肌肉異?；顒佣鹊拇笮∨c顳下頜關節(jié)組織病理改變存在正相關關系，即肌肉異常牽引力度越大，關節(jié)病變越嚴重。也有研究表明顳下頜關節(jié)對負荷首先表現為細胞的增殖，其中以軟骨細胞最為活躍，隨負荷增加，損傷過程大于修復過程，出現軟骨基質的進行性破壞。目前，關節(jié)內壓可能引起髁突軟骨細胞凋亡的體外實驗成為國內外基礎研究的熱點，本研究旨在通過對髁突軟骨細胞施加不同時間和大小的靜水壓力，觀察TRPM7和Fas蛋白的表達變化，探討不同靜水壓力可能對軟骨細胞凋亡產生的影響。

1材料和方法

1.1材料：PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天），30%丙烯酰胺、TEMED、SDS上樣緩沖液（Amreseo），電轉液（西格瑪奧貿易有限公司），蛋白marker（14-120KD）（北京全氏金生物技術有限公司），蛋白marker（10-250KD）（fermentas），PVDF膜（0.45um）（Millipore）、兔抗GAPDH 37KD（杭州賢至生物有限公司），兔抗TRPM7 213KD（abeam），兔抗FAS 48KD（Santa Cruz），HRP標記羊抗兔二抗（LTD），ECL底物液（Thermo），X光膠片（柯達），顯影定影試劑盒（武漢巴菲爾生物）。

1.2方法

1.2.1制備MCCs：無菌條件解剖大鼠下頜骨，眼科組織剪剖離髁突軟骨并剝離軟骨表面的纖維被膜，然后將軟骨切成1mm×1mm×1mm大小組織塊，0.2%Ⅱ膠原酶避光消化18～20h，獲取MCCs。而后制備細胞懸液接種于100mm培養(yǎng)皿中，“+”鋪勻，待細胞長滿皿底80%左右時進行傳代。

1.2.2施加靜水壓力：參考Ryuichi Kunii等的加壓方法，取生長良好的第3代細胞，待生長達對數期時，隨機分為兩組，Fas組和TRPM7組。采用加壓氣囊裝置向培養(yǎng)瓶內充氣至壓力表指針達到要求的壓強強度，立即移入培養(yǎng)孵箱并計時。加壓時間設置為1h、2h，每時間點給予OkPa、6kPa、8kPa、10kPa、20kPa、30kPa的壓力，以OkPa作為對照。每組每壓力條件下設置4個復孔，當加壓結束后，立即收集細胞用Western Blot檢測蛋白，每孔重復測量3次。

1.2.3蛋白樣品的制備：①提取細胞總蛋白：倒凈培養(yǎng)液，每瓶加3ml預冷的PBS（4℃）洗滌細胞3次，棄PBS后把培養(yǎng)瓶置于冰上，加400μ裂解液/瓶，冰上裂解30min，收集細胞碎片和裂解液，4℃下12000rpm離心5min，0.5ml的離心管分裝離心后的上清，-20℃保存；②蛋白濃度的測定：稀釋蛋白樣品和BSA標準品，用DG一3022A酶標儀測定0D568，根據標準蛋白濃度和相應的OD值計算直線回歸方程，根據蛋白樣品OD值，利用回歸方程計算出樣品蛋白濃度；③蛋白變性：將提取的蛋白上清與5x蛋白上樣緩沖液，放入沸水中進行沸水浴10min。

1.2.4電泳分離實驗：①配制電泳膠：12%分離膠（總體系20m1）、8%分離膠（總體系20m1）、濃縮膠5%（總體系6m1）；②電泳分離：將制備好的膠固定到電泳槽上，儲液池中倒入電泳液，將制備好的蛋白樣品和MAKER加入上樣孔，各樣品總蛋白量為40μg，行電泳分離。

1.2.5電轉移實驗：轉膜儀內放好夾緊板后的黑色板—纖維墊—濾紙—凝膠—PVDF膜—濾紙—纖維墊—白色板，黑色板對應黑色負極，加滿電轉液開始轉膜。

1.2.6免疫印跡顯色：采用ECL顯色系統(tǒng)。將PVDF膜浸泡于TBST中，室溫搖床封閉2h，將PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜。洗去一抗加入二抗，37℃搖床孵育2h。TBST充分洗滌PVDF膜，以便洗去二抗，滴加工作液于PVDF膜上，待熒光帶明顯后，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后行顯影和定影，沖洗膠片。

1.2.7蛋白表達量測定：晾干后掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值，以抗大鼠GAPDH作為內參，Fas/GAPDH和TRPM7/GAPDH作為蛋白相對表達量。

1.3統(tǒng)計學分析：采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，不同壓力時間下，組內進行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。endprint

2結果

不同壓力條件下Fas和TRPM7，總蛋白各有一條灰色條帶，灰度值不同，加壓1h、2h后，檢測各組蛋白含量。

2.1 Fas蛋白表達量測定結果：①隨著壓力值的增大，Fas蛋白表達呈先下降后增高趨勢，見圖1～2；②當靜水壓力為6kPa、8kPa、10kPa，實驗組每組蛋白量均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05；③當靜水壓力為20kPa/2h、30kPa/1h、30kPa/2h時，實驗組蛋白量均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05；④但20kPa/1h時，實驗組的蛋白量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。見表1。

2.2 TRPM7蛋白表達量測定結果：①隨著壓力值的增大，TRPM7蛋白表達呈先下降后增高趨勢，見圖3～4；②當靜水壓力為6kPa、8kPa、10kPa、20kPa，實驗組每組蛋白量均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05；③當靜水壓力為30Kpa/2h時，實驗組蛋白量均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05；④但30kPa/1h時，實驗組的蛋白量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。見表2。

3討論

顳下頜關節(jié)紊亂病（Temporomandibular disorders，TMD）是多種致病因素共同作用所致的一組疾病的總稱，共同作用因素包括原始因素、始動因素（誘因）和持續(xù)作用因素。近年來國內外研究著重于強調行為和社會心理因素對TMD的影響。有研究表明當壓力負荷過大或者持續(xù)過久時，可對關節(jié)軟骨造成損傷，單一或反復的損傷是引起骨關節(jié)炎的始動因素。前期研究發(fā)現精神壓力對TMD病變可產生影響，其可能機制是精神緊張引起全身肌肉收縮，進而將力量傳遞給下頜骨（articulatio mandibularis，OR），增加顳下頜關節(jié)（Tempromendibular Joint，TMJ）腔內壓力，造成軟骨病變。髁突軟骨退行性病變是TMD的病理改變之一，髁突軟骨細胞作為髁突軟骨唯一細胞成分，其增殖和凋亡直接影響TMJ的生理病理狀態(tài)。有相關實驗表明力學刺激對軟骨細胞的生長分化起著重要作用，也有學者利用不同靜水壓力施加于TMJ滑膜細胞，發(fā)現靜水壓力達到或超過一定范圍時大鼠顳下頜關節(jié)滑膜細胞出現線粒體腫脹、胞質空泡樣變等超微結構改變，并出現類似包涵體的凋亡小體，且變化程度隨壓力增大而加重，推測其機制可能與壓力激活凋亡基因有關。本實驗通過模擬軟骨細胞體內生存環(huán)境，觀察不同靜水壓力作用下Fas和TRPM7蛋白表達情況，從而探究壓力作用下軟骨細胞凋亡可能存在的變化規(guī)律。

Fas又稱Apo-1，是存在于細胞膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，Fas與其相應的配體結合后可傳遞一種細胞凋亡信號，誘導細胞發(fā)生凋亡的一系列生化反應或形態(tài)學改變。Fas及配體也是近年來研究細胞凋亡最為熱點的膜表面分子，故研究探討其在細胞凋亡中的變化對闡明TMD病理機制具有深遠意義。Fas基因是公認的凋亡活化基因，在凋亡活化階段發(fā)揮重要作用。Fas及配體在關節(jié)軟骨中高表達，故Fas途徑常被認為是軟骨細胞凋亡途徑之一。王擁軍等人。也證實了Fas通路能誘導體外培養(yǎng)的髁突軟骨細胞發(fā)生嚴重凋亡。本研究在壓力時間為1h、2h時，6～10kPa組的Fas蛋白較0kPa組低，且差異有統(tǒng)計學意義。該結果提示軟骨細胞凋亡在較小壓力條件下可能是呈抑制狀態(tài)的。這與張曼等人的研究結果即力學刺激對髁突軟骨細胞的生物學反應具有重要意義，也可能是髁突保持終生改建能力的重要生物學基礎之一相一致。同時，適度的負重對維持關節(jié)的正常結構、功能和生理改建是必須的，具有重要意義。這一觀點與本研究結果也相符。當壓力值為20kPa/1h時，實驗組與0kPa組無統(tǒng)計學差異，但當壓力值不變，時間延長為2h，實驗組蛋白高于0kPa組，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當加壓時間為1h不變，延長壓力時間為30kPa時，實驗組蛋白又高于0kPa組，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。本結果表明當壓力值和/或時間超過一定界值時可抑制Fas蛋白的表達，即過度的壓力刺激可能促進軟骨細胞凋亡。本實驗結果支持王世東的觀點，即健康狀態(tài)下的關節(jié)軟骨可以承受一定時間和一定強度的外力，一旦超過一定強度或時間，可對關節(jié)軟骨造成損傷，損傷程度與力的大小、類型、程度及持續(xù)時間有關。

TRPM7（transient receptor potential melastatin-7）是存在于細胞膜上的壓力敏感通道，參與多種生理功能，包括細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡及細胞死亡等，近年來對其研究較為深入。TRPM7通道在2003年被Arts證實：在缺糖缺氧條件下，該通道在神經元死亡過程中起重要作用。該通道可能也在軟骨細胞凋亡機制中起到重要作用。本研究在壓力值為1h、2h時，6～20kPa組的TRPM7蛋白較0kPa組低，且差異有統(tǒng)計學意義。提示較小的壓力條件可能對軟骨細胞的凋亡有抑制作用。壓力值為30kPa/1h時，兩組比較無統(tǒng)計學差異，但當時間調整為2h時，實驗組比0kPa組蛋白量高，差異具有統(tǒng)計學意義P<0.05。提示該壓力條件下，軟骨細胞凋亡可能是增長的。上述實驗提示我們一定壓力負荷內，可抑制軟骨細胞TPPM7蛋白表達，當壓力超過一定界值后，該蛋白表達增加。這與Fas蛋白表達變化規(guī)律基本一致，我們推測TRPM7也可能參與了壓力作用下MCCs的凋亡。

4結論

本次研究根據體外培養(yǎng)的髁突軟骨細胞在不同條件靜水壓力下，觀察軟骨細胞Fas和TRPM7蛋白變化規(guī)律，探討了不同壓力可能與髁突軟骨細胞凋亡之間的關系：①適當壓力范圍時，可抑制Fas蛋白和TRPM7蛋白的表達，有可能與軟骨細胞凋亡受抑制有關；②壓力超過一定范圍后，Fas蛋白和TRPM7蛋白表達均上調，有可能與軟骨細胞凋亡增加有關。即Fas通路和TRPM7通路都有可能參與髁突軟骨細胞凋亡，但仍需進一步實驗證實此結論。這或許為TMD的臨床防治提供思路。endprint