紫斑牡丹花粉不同濃度乙醇提取物抗氧化能力研究

王斌利+張莉霞+石曉峰+李運(yùn)+王新娣+邱國玉+沈薇+李志俊

摘要：目的 評價(jià)紫斑牡丹花粉的不同濃度乙醇提取物的抗氧化能力。方法 通過測定紫斑牡丹花粉不同濃度乙醇提取物的3種抗氧化能力（銅離子還原能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力），對紫斑牡丹花粉不同濃度乙醇提取物的抗氧化性能進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果 銅離子還原能力法測得紫斑牡丹花粉無水乙醇提取物、75%乙醇提取物、50%乙醇提取物、25%乙醇提取物和水提取物的抗氧化活性沒食子酸量依次為26.00、28.33、28.90、14.98、9.24 mg/g；紫斑牡丹花粉不同濃度乙醇提取物的清除DPPH自由基和ABTS自由基能力均低于維生素C，其順序依次為：50%乙醇提取物>75%乙醇提取物>無水乙醇提物>25%乙醇提取物>水提取物。結(jié)論 紫斑牡丹花粉不同濃度乙醇提取物均具有較強(qiáng)的抗氧化能力，以50%、75%乙醇提物的抗氧化能力最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：紫斑牡丹花粉；不同濃度乙醇提取物；抗氧化性能；銅離子還原能力法；DPPH自由基清除法；ABTS自由基清除法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.015

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）02-0065-04

Study on Antioxidant Activity of Different Concentrations of

Alcohol Extracts from Paeonia Rockii Pollen

WANG Bin-li1，2， ZHANG Li-xia2， SHI Xiao-feng1，2， LI Yun3， WANG Xin-di1， QIU Guo-yu3， SHEN Wei1， LI Zhi-jun3

1. Gansu Academy of Medical Science， Lanzhou 730050， China； 2. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 3. Lanzhou Institute for Food and Drug Control， Lanzhou 730030， China

Abstract： Objective To evaluate the antioxidant activity of different concentrations of alcohol extracts from Paeonia Rockii pollen. Methods The antioxidant activity of different concentrations of alcohol extracts from Paeonia Rockii pollen was evaluated by cupric reducing power method， DPPH radical scavenging activity method and ABTS radical scavenging activity method. Results The amounts of antioxidant activity of gallic acid of anhydrous ethanol extract， 75% alcohol extract， 50% alcohol extract， 25% alcohol extract， and water extract from Paeonia Rockii pollen were 26.00， 28.33， 28.90， 14.98， and 9.24 mg/g， respectively. The sequence of the ability of scavenging DPPH free radical and ABTS radical was Vc > 50% alcohol extract > 75% alcohol extract > anhydrous ethanol extract > 25% alcohol extract > water extract. Conclusion The different concentrations of alcohol extracts from Paeonia Rockii pollen has relatively strong antioxidant activity， especially for 50% alcohol extract and 75% alcohol extract.

Keywords： Paeonia Rockii pollen； different concentrations of alcohol extracts； antioxidant activity； cupric reducing power method； DPPH radical scavenging activity method； ABTS radical scavenging activity method

紫斑牡丹Paeonia rockii為毛茛科Ranunculaceae芍藥屬Paeonia L.多年生木本植物，又名甘肅牡丹、西北牡丹，因其花瓣基部有一個(gè)明顯的色斑而得名[1]，是僅次于中原牡丹品種群的第二大品種群[2]，是我國中西部地區(qū)的特有中藥材和花中珍品。其分布于四川北部、甘肅南部及陜西秦嶺中段以西部分，被列為國家珍稀瀕危三級重點(diǎn)保護(hù)植物[3]。近10年來，紫斑牡丹在甘肅省隴南、天水、定西、臨夏及蘭州等地廣泛種植，不僅是一種重要的觀賞植物，其根皮作為藥用牡丹皮被甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)收載并對其有效成分進(jìn)行了研究[4-5]。endprint

有研究表明，鳳丹牡丹花粉中含有大量可以促進(jìn)健康、增加機(jī)體防御能力的天然活性物質(zhì)，其黃酮類成分具有很好的抗氧化活性[6-7]，而有關(guān)紫斑牡丹花粉的開發(fā)研究目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。為了進(jìn)一步對紫斑牡丹進(jìn)行開發(fā)利用，本研究通過測定紫斑牡丹花粉不同濃度乙醇提取物的3種抗氧化能力（銅離子還原能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力），評價(jià)紫斑牡丹花粉不同濃度乙醇提取物的抗氧化性能。

1 儀器與試藥

UV-240紫外分光光度儀（日本島津公司），AE260 萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），CP225D型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司），KQ2200B超聲清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司），HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

2，9-二甲基-1，10菲啰啉（新亞銅靈，批號20160307，含量>98%），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸對照品（批號110831-200803，供含量測定用），中國食品藥品檢定研究院；維生素C（Vc，批號Q/12HB3966-2009，含量>99.8%），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯代苦味?；?，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·），2，2'-連氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（[2，2'-azino-bis（3- ethylbenzothiazoline）-6-sulphonic acid] diamonium salt，ABTS·），美國Sigma公司；其他試劑均為分析純；水為蒸餾水。

紫斑牡丹花粉于2015年5月采自蘭州新區(qū)中川牡丹園，其原植物經(jīng)蘭州牡丹園藝開發(fā)公司趙潛龍高級工程師鑒定為Paeonia rockii（S. G. Haw et L. A. Lauener）T. Hong et J. J. Li。

2 方法與結(jié)果

2.1 銅離子還原能力法測定抗氧化活性

2.1.1 檢測試劑的制備

氯化銅溶液：精密稱取氯化銅90 mg，用水溶解并定容于50 mL容量瓶中，備用。醋酸銨溶液：精密稱取醋酸銨3800 mg，用水溶解并定容于50 mL容量瓶中，備用。新亞銅靈溶液：于暗室精密稱取新亞銅靈79 mg，用甲醇溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，備用（現(xiàn)配現(xiàn)用，4 ℃避光保存）。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對照品1.40 mg，用50%甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成濃度為0.014 mg/mL的對照品溶液，備用。

2.1.3 供試品貯備液的制備

精密稱取紫斑牡丹花粉5份，每份2.00 g，置于100 mL圓底燒瓶中，分別加入25倍量的不同溶劑（無水乙醇、75%乙醇、50%乙醇、25%乙醇、水），稱定質(zhì)量，加熱回流提取2 h，取出，放冷，再次稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，靜置，取上清液，置于4 ℃冰箱中，備用。

2.1.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取沒食子酸對照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于1 mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，配制成系列濃度的沒食子酸對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液各1 mL，依次加入氯化銅溶液、新亞銅靈溶液及乙酸銨溶液各1 mL，再加入水1 mL，即得系列濃度的沒食子酸對照品反應(yīng)液；精密吸取50%甲醇1 mL，依次加入氯化銅溶液、新亞銅靈溶液及乙酸銨溶液各1 mL，再加入水1 mL，即得空白反應(yīng)液。分別將充分混勻后的沒食子酸對照品反應(yīng)液和空白反應(yīng)溶液于室溫下放置反應(yīng)30 min，以空白反應(yīng)液為參比，于450 nm波長處測定系列濃度沒食子酸對照品反應(yīng)液的吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y=38.778X-0.011 4，r2=0.999 2。結(jié)果表明，沒食子酸質(zhì)量在7×10-4～14×10-3 mg范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 樣品活性測定

參考文獻(xiàn)[8]方法，精密吸取供試品貯備液各0.1 mL，置于10 mL容量瓶中，加不同提取溶劑定容至刻度，得到供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液1 mL，依次加入氯化銅溶液、新亞銅靈溶液及乙酸銨溶液各1 mL，然后再加入1 mL蒸餾水，即得供試品反應(yīng)液。精密吸取供試品提取對應(yīng)溶劑1 mL，依次加入氯化銅溶液、新亞銅靈溶液及乙酸銨溶液各1 mL，最后加入1 mL蒸餾水，得到空白反應(yīng)液。分別將充分混勻后的供試品反應(yīng)液和空白反應(yīng)液于室溫下放置反應(yīng)30 min，以空白反應(yīng)液為參比，于450 nm波長處測定供試品反應(yīng)液的吸光度，再將測得的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得X，計(jì)算供試品的抗氧化活性沒食子酸量（X×N×V÷m，N為稀釋倍數(shù)，V為供試品總體積，m為稱樣量），結(jié)果水提液及25%、50%、75%、100%乙醇提取液中沒食子酸含量分別為9.24、14.98、28.90、28.33、26.00 mg/g。

2.2 不同濃度乙醇提取物清除自由基能力測定

2.2.1 溶液的配制

DPPH·溶液：精密稱取DPPH· 8 mg，置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，即得。

ABTS·溶液：精密稱取ABTS· 0.192 2 g，置于100 mL棕色容量瓶中，用水溶解并定容，即得A液；精密稱取過硫酸鉀0.067 6 g，置于100 mL棕色容量瓶中，用水溶解并定容，即得B液。按體積比2∶1將A、B液混勻，避光12 h，備用。臨用前用無水乙醇稀釋至吸光度為0.6±0.1，得ABTS·工作液。

Vc對照品溶液：精密稱取Vc對照品20 mg，置于5 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容，即得濃度為4 mg/mL的Vc對照品溶液。endprint

2.2.2 DPPH自由基清除率測定

參考文獻(xiàn)[9]方法，將“2.1.3”項(xiàng)下制備的不同濃度乙醇提取液及Vc對照品溶液稀釋成0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mg/mL系列濃度溶液。分別精密移取上述供試品溶液及Vc對照品溶液各1 mL，置于10 mL比色管中，各加DPPH·溶液2 mL，再加各供試品和對照品的對應(yīng)溶劑2 mL，搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長處測定吸光度值（A1），同時(shí)以無水乙醇為參比，測定DPPH·空白溶液吸光度值（A0），計(jì)算清除率。DPPH自由基清除率（%）=（A0-A1）÷A0×100%。結(jié)果見圖1。

2.2.3 ABTS自由基清除率測定

將“2.1.3”項(xiàng)下制備的不同溶劑提取液及Vc對照品溶液稀釋成8、16、32、48、64、80 μg/mL系列濃度溶液。分別精密移取上述供試品溶液及Vc對照品溶液各1 mL，置于10 mL比色管中，各加ABTS·溶液2 mL，再加各供試品和對照品的對應(yīng)溶劑2 mL，搖勻，放置10 min后在734 nm波長處測定吸光度值（A1），同時(shí)以水為參比測定ABTS·空白溶液吸光度值（A0），計(jì)算清除率。ABTS自由基清除率（%）=（A0-A1）÷A0×100%。結(jié)果見圖2。

3 討論

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道多通過DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基、羥自由基清除能力和鐵離子、銅離子還原能力等來評價(jià)樣品的抗氧化能力[10-13]。其中，銅離子還原能力法是用于測定多組分混合物的抗氧化活性的，可同時(shí)用于評價(jià)親脂性和親水性抗氧化劑的抗氧化活性，反應(yīng)不易受光、空氣、氧、pH值等因素的影響[14-15]。但不同的測定方法各有利弊，在評價(jià)樣品體外抗氧化能力時(shí)應(yīng)盡量多地采用適合于樣品性質(zhì)和多種方法進(jìn)行抗氧化性評價(jià)，才能全面反映待測物質(zhì)的抗氧化活性。為此，本研究采用銅離子還原能力法結(jié)合DPPH、ABTS自由基清除法綜合評價(jià)紫斑牡丹花粉不同濃度乙醇提取物的抗氧化活性。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，銅離子還原能力測得紫斑牡丹花粉無水乙醇提取物、75%乙醇提取物、50%乙醇提取物、25%乙醇提取物及水提取物的抗氧化活性沒食子酸量依次為26.00、28.33、28.90、14.98、9.24 mg/g；DPPH和ABTS的自由基清除能力所得結(jié)果基本一致，紫斑牡丹花粉不同濃度乙醇提取物清除DPPH自由基和ABTS自由基能力均低于Vc，其順序依次為：50%乙醇提取物>75%乙醇提取物>無水乙醇提物>25%乙醇提取物>水提取物。由此可見，50%、75%乙醇提取物抗氧化活性最強(qiáng)。

動脈粥樣硬化、癌癥、神經(jīng)性疾病等多種疾病都與氧化脅迫有關(guān)[16]，許多外源性小分子作為抗氧化劑可以抵抗活性氧造成的危害。紫斑牡丹花粉50%、75%乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可能與其所含黃酮類和多酚類化合物有關(guān)[7，17]。我們計(jì)劃后續(xù)研究將其開發(fā)成可供利用的天然抗氧化劑，用于疾病預(yù)防。

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