醒鼻溫敏凝膠劑對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠血清白細(xì)胞介素—4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—β1和鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞的影響

邱彩霞+鄭健+林東紅+艾斯+吳博+莊翔莉+翁珂涵+李旭微

摘要：目的 觀察醒鼻溫敏凝膠劑對(duì)變應(yīng)性鼻炎（AR）大鼠血清白細(xì)胞介素-4（IL-4）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）及鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）計(jì)數(shù)的影響，探討其作用機(jī)制。方法 以卵清白蛋白加氫氧化鋁腹腔注射基礎(chǔ)致敏，局部以2%卵清白蛋白激發(fā)成功復(fù)制AR模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和醒鼻低、中、高劑量組，各給藥組給予相應(yīng)藥物干預(yù)。比較各組大鼠癥狀評(píng)分，檢測(cè)血清IL-4、TGF-β1含量和鼻黏膜EOS計(jì)數(shù)。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-4、TGF-β1含量明顯升高（P<0.01），鼻黏膜組織EOS計(jì)數(shù)明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，醒鼻中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組血清IL-4、TGF-β1含量明顯降低（P<0.01），鼻黏膜組織EOS計(jì)數(shù)明顯減少（P<0.05）。結(jié)論 醒鼻溫敏凝膠劑可能通過下調(diào)IL-4、TGF-β1等炎癥因子水平及減少鼻黏膜EOS浸潤(rùn)而發(fā)揮治療作用。

關(guān)鍵詞：醒鼻溫敏凝膠劑；白細(xì)胞介素-4；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.011

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）02-0047-04

Effects of Xingbi Wenmin Gel on Serum Levels of IL-4， TGF-β1

and Nasal Mucosa Eosinophils in Allergic Rhinitis Rats

QIU Cai-xia1， ZHENG Jian2， LIN Dong-hong1， AI Si1， WU Bo3，

ZHUANG Xiang-li2， WENG Ke-han1， LI Xu-wei1

1. Peoples Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350004， China；

2. Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China；

3. The Second Affiliated Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350001， China

Abstract： Objective To observe the effects of Xingbi Wenmin Gel on serum levels of IL-4， TGF-β1 and nasal mucosa eosinophils （EOS） in allergic rhinitis （AR） rats； To discuss its mechanism of action. Methods Intraperitoneal injection of egg albumin and aluminum hydroxide based sensitized to ovalbumin challenge 2% local AR model was established successfully. The experimental rats were randomly divided into normal group， model group， positive control group， and Xingbi Gel low-， medium-， and high-dosage groups. Each medication group was given relevant medicine for intervention. The rat symptom scores in each group were compared， and serum IL-4， TGF-β1， and nasal mucosa EOS counts were detected. Results Compared with the normal group， the serum levels of IL-4 and TGF-β1 in model group increased significantly （P<0.01）， and the nasal mucosa EOS counts increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the serum levels of IL-4 and TGF-β1 in Xingbi Gel medium-dosage group and positive control group decreased significantly （P<0.01）， and the nasal mucosa EOS counts decreased significantly （P<0.05）. Conclusion Xingbi Wenmin Gel may be effective through down-regulation of IL-4， TGF-β1 levels of inflammatory factors， and reduction of EOS infiltration in nasal mucosa.

Keywords： Xingbi Wenmin Gel； IL-4； TGF-β1； eosinophilia counts； ratsendprint

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的變態(tài)反應(yīng)性疾病，其發(fā)病核心機(jī)制是鼻黏膜局部免疫球蛋白IgE介導(dǎo)的炎性反應(yīng)伴嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）的浸潤(rùn)。流行病學(xué)調(diào)查顯示，AR平均發(fā)病率為10%～21%[1]，且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。目前治療主要針對(duì)減少機(jī)體炎性反應(yīng)及EOS浸潤(rùn)，臨床上以糖皮質(zhì)激素為主要代表藥物，但長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用醒鼻溫敏凝膠劑治療AR大鼠，觀察其對(duì)AR大鼠血清白細(xì)胞介素-4（IL-4）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）及鼻黏膜EOS計(jì)數(shù)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠90只，3～4周齡，雌雄各半，體質(zhì)量（220±20）g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2012-0011。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，光暗周期為12 h/12 h，溫度（25.0±0.5）℃，相對(duì)濕度50%～70%，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

醒鼻溫敏凝膠劑（人工牛黃、蟬蛻、冰片、薄荷、徐長(zhǎng)卿等），福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥劑科提供，批號(hào)20160927；雷諾考特，阿斯利康制藥有限公司，批號(hào)GH506。

1.3 主要試劑與儀器

卵清白蛋白（OVA，SIGMA公司），批號(hào)A5503；氫氧化鋁（SIGMA公司），批號(hào)BE084672；IL-4、TGF-β1 ELISA試劑盒（R&D公司），批號(hào)0675481；HE染色試劑盒（上海碧云天生物科技公司），批號(hào)C0105；福爾馬林試劑（上海威奧生物科技）。CS-1EAS型電子天平（北京市菲姆斯科技開發(fā)公司），低速離心機(jī)（湖南湘儀），CUT4060型石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

參照文獻(xiàn)[2]方法。①基礎(chǔ)致敏，每只大鼠以O(shè)VA 0.5 mg作抗原，氫氧化鋁粉末30 mg作佐劑，加生理鹽水1 mL形成混懸液，腹腔注射，隔日1次，共7次。②局部激發(fā)，在腹腔注射致敏完成后第4日，大鼠取頭低位，用微量加樣器每側(cè)鼻腔滴預(yù)先配制的2%劑量OVA溶液50 μL激發(fā)，隔日1次，共5次。激發(fā)時(shí)間為當(dāng)日第1次滴鼻給藥1 h后。參照1997年（?？冢┬抻喌娜珖?guó)變應(yīng)性鼻炎診斷及療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，每次OVA雙側(cè)鼻腔滴鼻激發(fā)后，觀察記錄30 min內(nèi)大鼠噴嚏、搔鼻次數(shù)、流涕量，采用疊加法計(jì)算總分，總分（a+b+c）≥5分表示造模成功。a.噴嚏：一次連續(xù)3～9個(gè)為1分，10～14個(gè)為2分，≥15個(gè)為3分。b.鼻癢：搔鼻2～3次為1分，3～5次為2分，5次以上為3分。c.流涕：流至鼻孔為1分，超過前鼻孔為2分，流涕滿面為3分。

2.2 分組及給藥

SD大鼠隨機(jī)抽取15只為正常組，成模大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和醒鼻低（12.5 μg/mL）、中（25 μg/mL）、高（50 μg/mL）劑量組，每組15只。各給藥組均于第7次（第21日）致敏注射后次日開始給藥，大鼠取頭低位，陽(yáng)性對(duì)照組給予雷諾考特藥液滴鼻，醒鼻各劑量組給予醒鼻溫敏凝膠劑滴鼻，滴入量為50 μL/側(cè)，均為雙側(cè)，正常組和模型組給予等量生理鹽水滴入。每日3次，連續(xù)11 d。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

第11日治療結(jié)束后，禁食過夜，次日10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采集血液標(biāo)本，按試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)IL-4、TGF-β1 OD值。

2.4 鼻黏膜病理 觀察

腹主動(dòng)脈采血后處死大鼠，用10%福爾馬林灌洗鼻腔，打開鼻蓋骨，充分暴露鼻甲及骨性鼻中隔，剝離完整鼻黏膜，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 醒鼻溫敏凝膠劑對(duì)模型大鼠鼻炎癥狀的影響

與正常組比較，模型組大鼠第21、32日鼻炎癥狀評(píng)分均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，第32日各給藥組大鼠鼻炎癥狀評(píng)分均降低，其中醒鼻中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組作用明顯（P<0.01）。結(jié)果見表1。

4.2 醒鼻溫敏凝膠劑對(duì)模型大鼠血清白細(xì)胞介素-4和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠IL-4、TGF-β1含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠IL-4、TGF-β1含量均降低，其中醒鼻中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組作用明顯（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.3 醒鼻溫敏凝膠劑對(duì)模型大鼠鼻黏膜病理形態(tài)和嗜酸性粒細(xì)胞的影響

正常組鼻黏膜血管數(shù)量很少，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管改變；模型組纖毛脫落、倒伏，小血管增生擴(kuò)張明顯，大量EOS浸潤(rùn)，黏膜下腺體數(shù)量明顯增加，腺體擴(kuò)張；各給藥組病理改變均較模型組改善，EOS浸潤(rùn)減少，且以醒鼻中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組改善明顯。見圖1。與正常組比較，模型組鼻黏膜EOS計(jì)數(shù)明顯增多（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組鼻黏膜EOS計(jì)數(shù)均減少，其中醒鼻中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組作用明顯（P<0.05）。見表3。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)采用目前公認(rèn)較為成熟的AR大鼠模型，通過OVA基礎(chǔ)致敏及局部激發(fā)，成功復(fù)制AR大鼠模型，應(yīng)用不同劑量的醒鼻溫敏凝膠劑和糖皮質(zhì)激素類藥物雷諾考特分別進(jìn)行治療。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，醒鼻溫敏凝膠劑可明顯改善AR大鼠鼻炎癥狀，明顯降低血清IL-4、TGF-β1水平，明顯改善鼻黏膜病理，減少EOS浸潤(rùn)，且以醒鼻中劑量組療效最優(yōu)。endprint

AR屬中醫(yī)“鼻鼽”范疇，外感風(fēng)邪是鼻鼽的重要誘發(fā)因素，隨季節(jié)變化又可兼夾寒、熱、濕等其他邪氣。祛風(fēng)解表通竅法是治療鼻鼽發(fā)作期的首選治療方法。醒鼻溫敏凝膠劑具有疏風(fēng)解表、醒鼻開竅的功效，可用于鼻鼽的發(fā)作期。其中徐長(zhǎng)卿性味辛溫，功能祛風(fēng)化濕、止癢止痛，為君藥；蟬蛻性味甘寒，功能疏風(fēng)清熱、利咽，有助徐長(zhǎng)卿止癢之功和除其過于辛燥之弊，為臣藥；牛黃性味甘涼，功能化痰開竅、清熱解毒，起佐助之效，為佐藥；天然冰片性味辛苦微寒，功能開竅醒神、清熱止痛，且能引藥上行，為使藥?？v觀全方，標(biāo)本兼治，諸藥合用，共奏疏風(fēng)清熱、開竅醒鼻之功效。

本實(shí)驗(yàn)中，醒鼻溫敏凝膠劑并未顯示出量效關(guān)系，主要原因是醒鼻溫敏凝膠劑是復(fù)方制備而成的納米脂質(zhì)體，分散于新型溫度敏感性水性凝膠材料的基質(zhì)中，接觸體表皮膚時(shí)能夠感應(yīng)體溫而形成凝膠[3]。它能較長(zhǎng)時(shí)間與鼻黏膜緊密黏附，使藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，增加鼻黏膜對(duì)藥物的吸收而不損害鼻黏膜，達(dá)到將藥物集中在鼻部而全身作用降到最小的目的。醒鼻低劑量較中劑量制劑藥液更稀薄，藥物吸附鼻腔能力不夠，在AR大鼠給藥中出現(xiàn)藥物從鼻腔中倒流。而醒鼻高劑量較中劑量制劑更濃稠，刺激性較強(qiáng)（中藥的刺鼻味），在給藥時(shí)大鼠較抗拒，給藥后往往引起鼻腔不適感，出現(xiàn)搔鼻、流涕等癥狀。相比之下，中劑量吸附力較好，又沒有過強(qiáng)的刺激性，故療效最佳。雖與西藥雷諾考特比較，醒鼻溫敏凝膠劑并無(wú)明顯差異，但其無(wú)激素類不良反應(yīng)，更適于兒童使用。

AR病理特征是以EOS浸潤(rùn)為主的慢性炎癥，EOS的生物學(xué)功能主要依靠其脫顆粒，人類EOS細(xì)胞質(zhì)內(nèi)約有200個(gè)折光性顆粒，這些顆粒主要包括堿性蛋白、EOS過氧化酶、EOS神經(jīng)毒素等。故EOS具有細(xì)胞毒性，表現(xiàn)在抑制T細(xì)胞增殖、促肥大細(xì)胞釋放組胺、刺激黏液分泌等[4]。EOS細(xì)胞表面有IL-4、IL-5等細(xì)胞因子受體，IL-4通過結(jié)合EOS表面受體刺激其分化，增強(qiáng)其黏附性、脫顆粒[5]。IL-4還可通過刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的CCL24從而誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞在體外遷移和局部浸潤(rùn)[6]。研究顯示，EOS可分泌TGF-β1，促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)活化，刺激膠原合成，參與組織重構(gòu)[7]。TGF-β1同時(shí)也能調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞，尤其T淋巴細(xì)胞及輔助T淋巴細(xì)胞的增殖、分化及免疫應(yīng)答等[8]。從本實(shí)驗(yàn)可以看出IL-4、TGF-β1與EOS表現(xiàn)為同向上升和下降，由此我們推論，Th2細(xì)胞分泌IL-4→結(jié)合EOS表面受體→刺激其分化，擴(kuò)增→誘導(dǎo)EOS遷移、局部浸潤(rùn)→分泌TGF-β1→促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)活化，參與組織重建和纖維化的過程。EOS分泌細(xì)胞因子參與炎癥的調(diào)節(jié)過程，同時(shí)，這些細(xì)胞因子又反過來(lái)促進(jìn)EOS移行、活化和自擴(kuò)增加，抑制其凋亡，增強(qiáng)代謝，促進(jìn)炎癥發(fā)展。如此循環(huán)往復(fù)，最終引起上皮損害脫落、組織水腫、血管增生，去鱗狀層和上皮細(xì)胞下層纖維化等病理變化[9]。

綜上，醒鼻溫敏凝膠劑可能通過下調(diào)IL-4、TGF-β1等炎癥因子水平及減少鼻黏膜EOS浸潤(rùn)而發(fā)揮治療作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] BUNERY P G， ZUBERBIER T， VAN CAUWENBERGE P. Global allergy and asthma European network[J]. Rev Mal Respir，2015，26：577-586.

[2] GUIBAS G V， SPANDOU E， MEDITSKOU S， et al. N-acetylcysteine exerts therapeutic action in rat model of allergic rhinitis[J]. International Forum of Allergy & Rhinology， 2013，3：1-7.

[3] CHU K， CHEN L， XU W， et al. Preparation of a paeonol-containing temperature-sensitive in situ gel and its preliminary efficacy on allergic rhinitis[J]. International Journal of Molecular Sciences，2013，14（3）：6499-6515.

[4] BYSTROM J， AMIN K， BISHOP-BAILEY D. Analysing the eosinophil cationic protein：a clue to the function of the eosinophil granulocyte[J]. Respir Res，2011，12：10.

[5] LE MOINE A， FLAMAND V， DEMOOR F X， et al. Critical roles for IL-4， IL-5 and eosinophils in chronic skin allograft rejection[J]. J Clin Invest，2014，103：1659.

[6] SIDDIQUI S， SECOR E J， SILBART L K. Broncho-alveolar macrophages express chemokinesassociated with leukocytemigration in amouse model of asthma[J]. Cell Immunol，2013，281（2）：159-169.

[7] ELOVIC A E， OHYAMA H， SAUTY A， et al. IL-4 dependent regulation of TGF-alpha and TGF-betal expression in human eosinophils[J]. J Immunol，1998，160：6121.

[8] YANG Y C， ZHANG N， VAN CROMBRUGGEN K， et al. Transforming growth factor-β1 in inflammatory airway disease：a key for understanding in inflammatory and remodeling[J]. Allergy，2012，67（10）：1193- 1202.

[9] 徐麗，張俊中，關(guān)兵，等.IL-4和嗜酸粒細(xì)胞在變應(yīng)性鼻炎及鼻息肉組織中的表達(dá)及意義[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2014，28（18）：1403-1406.endprint