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    羅氏核酸檢測(cè)試劑在無(wú)錫血站的應(yīng)用分析

    2018-02-01 21:57:44胡越高犁蔣瑞馨
    關(guān)鍵詞:窗口期獻(xiàn)血者乙肝

    胡越,高犁,蔣瑞馨

    (無(wú)錫市中心血站檢驗(yàn)科,江蘇 無(wú)錫 214021)

    HBV、HCV和HIV等傳染病的經(jīng)血傳播一直是影響輸血安全的關(guān)鍵因素。根據(jù)國(guó)家《獻(xiàn)血者健康檢查要求》的規(guī)定,血站必須對(duì)獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行乙肝表面抗原、丙肝抗體和艾滋病抗體酶免檢測(cè)。這雖然大大降低了經(jīng)血傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn),但由于酶免檢測(cè)存在較長(zhǎng)的“窗口期”,仍無(wú)法完全避免輸血傳播疾病的發(fā)生[1]。而且有部分處于乙肝隱匿性感染狀態(tài)下的獻(xiàn)血者獻(xiàn)血,這是常規(guī)酶免檢測(cè)方法無(wú)法篩查出來(lái)的[2]。近年來(lái),具有高敏感度、高特異性的核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(NAT)在部分發(fā)達(dá)國(guó)家的獻(xiàn)血者篩查中得到應(yīng)用,極大地縮短了乙肝表面抗原、丙肝抗體和艾滋病抗體檢測(cè)的“窗口期”,因酶免檢測(cè)漏檢而導(dǎo)致的輸血后病毒感染顯著減少[3]。為摸索適合本站實(shí)際情況的核酸擴(kuò)增檢測(cè)方案,筆者對(duì)本站129299份酶免檢測(cè)合格的獻(xiàn)血者血液標(biāo)本使用美國(guó)羅氏診斷公司核酸聯(lián)合檢測(cè)試劑盒進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè),以分析羅氏MPX試劑在無(wú)錫地區(qū)獻(xiàn)血者篩查中應(yīng)用情況。

    1 材料與方法

    1.1 標(biāo)本來(lái)源 2013年4月至2016年5月本站酶免檢測(cè)合格的獻(xiàn)血者血液標(biāo)本129299人份。

    1.2 儀器 STAR全自動(dòng)加樣系統(tǒng)、FAME酶免處理系統(tǒng)、哈密爾頓全自動(dòng)混樣儀、羅氏核酸提取儀、羅氏核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀、DL-5M低溫離心機(jī)。

    1.3 試劑 美國(guó)羅氏診斷公司乙肝、丙肝、人類免疫缺陷病毒(1+2)NAT檢測(cè)試劑盒(Cobas Taq-Screen MPX)。北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)公司,廈門英科新創(chuàng)科技公司,北京科衛(wèi)生物科技公司乙肝、丙肝、人類免疫缺陷病毒ELISA檢測(cè)試劑盒。

    1.4 方法 獻(xiàn)血者采血結(jié)束后留取3管血液標(biāo)本(2支用于酶免等常規(guī)檢測(cè);1支用于核酸擴(kuò)增檢測(cè))。血液采集后按要求及時(shí)離心,4℃冰箱保存。第二日先進(jìn)行酶免檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果為陰性的血液標(biāo)本則進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)。用哈密爾頓全自動(dòng)混樣儀、羅氏核酸提取、擴(kuò)增與檢測(cè)儀對(duì)血液標(biāo)本進(jìn)行混樣和檢測(cè)。每6份血液標(biāo)本分別吸取167μl進(jìn)行匯集后用于合并檢測(cè)核酸。每批檢測(cè)均設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照和三個(gè)陽(yáng)性對(duì)照,每個(gè)歸集混樣管均含有內(nèi)標(biāo)對(duì)照(IC)。陰性對(duì)照不能檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào),而陽(yáng)性對(duì)照和內(nèi)標(biāo)對(duì)照能檢測(cè)到的擴(kuò)增信號(hào)應(yīng)符合試劑盒要求,否則本批實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為無(wú)效結(jié)果。若1個(gè)歸集混樣管的檢測(cè)結(jié)果為陰性,則該歸集混樣管中的6個(gè)標(biāo)本均為陰性;若1個(gè)歸集混樣管的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,則需要對(duì)該歸集混樣管中的6個(gè)標(biāo)本做單獨(dú)拆分檢測(cè),根據(jù)單個(gè)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果來(lái)判定為NAT陽(yáng)性或者NAT陰性。

    將判定為NAT陽(yáng)性的血液標(biāo)本冷凍保存,統(tǒng)一送江蘇省血液中心作確認(rèn)實(shí)驗(yàn)和定量分析,對(duì)乙肝NAT陽(yáng)性的血液標(biāo)本用化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)系統(tǒng)做乙肝“兩對(duì)半”檢測(cè)。對(duì)酶免檢測(cè)陰性、核酸擴(kuò)增檢測(cè)陽(yáng)性的獻(xiàn)血者進(jìn)行追蹤,采集血液標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)酶免檢測(cè)和核酸擴(kuò)增檢測(cè)。

    2 結(jié)果

    對(duì)酶免檢測(cè)為陰性的129299人份血液標(biāo)本進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè),共檢測(cè)出HBV DNA陽(yáng)性129例,HCV RNA陽(yáng)性1例,HIV RNA陽(yáng)性1例。對(duì)129例HBV DNA陽(yáng)性血液進(jìn)行HBV熒光定量檢測(cè),共發(fā)現(xiàn)65例病毒拷貝數(shù)<20IU/ml,16例病毒拷貝數(shù)>50IU/ml,剩余48例定量試驗(yàn)呈陰性。81例HBV DNA陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)有73例為乙肝e抗體(HBeAb)和核心抗體(HBcAb)陽(yáng)性。對(duì)7例HBV DNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者于獻(xiàn)血30d后采集血樣進(jìn)行檢測(cè),仍然為HBsAg陰性,HBV DNA陽(yáng)性。HCV RNA陽(yáng)性血液首次病毒定量為 4.27×106IU/ml,32d后本血站對(duì)該名獻(xiàn)血員采血復(fù)查,抗-HCV ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性,核酸檢測(cè)均有反應(yīng)性,核酸定量檢測(cè)病毒載量為 4.68×103IU/ml。 對(duì) 1例 HIV RNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者首次和隨訪兩次檢測(cè)結(jié)果見表1。

    3 討論

    核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)在我國(guó)獻(xiàn)血者血液篩查方面的優(yōu)勢(shì)日益明顯。研究表明隱匿性乙肝感染者與處于乙肝血清標(biāo)志物轉(zhuǎn)陽(yáng)前(窗口期)的獻(xiàn)血者是造成乙肝表面抗原酶免檢測(cè)后仍然導(dǎo)致輸血感染乙肝的主要原因[2],處于“窗口期”的獻(xiàn)血者的乙肝血清標(biāo)志物會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而轉(zhuǎn)為陽(yáng)性,而隱匿性乙肝感染者的乙肝血清標(biāo)志物一般不會(huì)轉(zhuǎn)為陽(yáng)性[4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中81例HBV DNA陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)有73例為乙肝e抗體(HBeAb)和核心抗體(HBcAb)陽(yáng)性,判斷其為乙肝病毒攜帶者或乙肝感染恢復(fù)期。對(duì)7例HBV DNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者于獻(xiàn)血30d后采集血樣進(jìn)行檢測(cè),仍然為HBsAg陰性,HBV DNA陽(yáng)性,符合隱匿型乙肝感染(OBI)的表現(xiàn)。

    窗口期一般是指從人體被病毒感染到人體外周血能檢測(cè)出該病毒標(biāo)志物的這段時(shí)間,如進(jìn)口酶免試劑做乙肝表面抗原、丙肝抗體和艾滋病抗體檢測(cè)的平均“窗口期”分別為 46d、71d、23d[5],混樣核酸擴(kuò)增檢測(cè)可將HBV、HCV和HIV檢測(cè)的 “窗口期”縮短到23d、58d和12d[6]。根據(jù)對(duì)HCV RNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者和HIV RNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者的追蹤檢測(cè),證實(shí)這分別是1例處于HCV感染 “窗口期”和1例處于HIV感染“窗口期”的獻(xiàn)血者。盡管核酸擴(kuò)增檢測(cè)只能縮短檢測(cè)感染的“窗口期”,但處在核酸檢測(cè)“窗口期”的血液傳染性極低,不少研究均表明核酸擴(kuò)增檢測(cè)與酶免檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果有互補(bǔ)之效,可降低因酶免檢測(cè)漏檢而產(chǎn)生的輸血后病毒感染幾率,顯著提高輸血安全性[7-9]。根據(jù)本人的核酸檢測(cè)結(jié)果證明,美國(guó)羅氏診斷公司核酸聯(lián)合檢測(cè)試劑盒應(yīng)用于獻(xiàn)血者血液篩查后,能在酶免檢測(cè)陰性的血液標(biāo)本中進(jìn)一步篩查出乙肝、丙肝和艾滋病核酸陽(yáng)性的獻(xiàn)血者標(biāo)本,避免了臨床患者因輸血而感染乙肝、丙肝和艾滋病的不良事件,產(chǎn)生了良好的社會(huì)效益。

    核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)可以忽略個(gè)體間的免疫應(yīng)答差異,能較早檢測(cè)出樣本中含量極低的病毒核酸成分,大大縮短檢測(cè)的“窗口期”,它與酶免檢測(cè)的原理和方法各不相同,所以將兩者結(jié)合在一起用于血液檢測(cè),先進(jìn)行酶免檢測(cè)去除陽(yáng)性標(biāo)本,再進(jìn)行核酸檢測(cè),不僅降低了核酸檢測(cè)工作量,而且消除了陽(yáng)性標(biāo)本易引起污染的影響因素[10]。同時(shí)核酸擴(kuò)增檢測(cè)又有別于傳統(tǒng)的酶免血清學(xué)檢測(cè),實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)極易造成假陽(yáng)性和假陰性,它對(duì)標(biāo)本處理方式、檢驗(yàn)操作規(guī)程、室內(nèi)質(zhì)控、實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和布局等問題有著更為嚴(yán)格的要求,這些問題還有待進(jìn)一步的探討。

    [1]Allain JP,Hewitt PE,TedderRS,et al.Evidence that anti-HBc but not HBV DNA testing may prevent some HBV transmission by transfusion[J].Br J Haematol,1999,107(1):186-195.

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    [6]任芙蓉.核酸檢測(cè)技術(shù)在國(guó)內(nèi)外血液篩查中應(yīng)用[J].北京醫(yī)學(xué),2008,30(8):561-564.

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