南瓜育種相關基礎研究進展

鄭 揚 張國裕 張 帆 田佳星 張沙沙， 王建書 李海真*

〔1北京農(nóng)林科學院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點實驗室，北京 100097；2河北工程大學園林與生態(tài)工程學院，河北邯鄲 056038〕

南瓜（Cucurbitaspp.）是世界范圍內(nèi)栽培的重要瓜類蔬菜。我國是南瓜生產(chǎn)與消費大國，播種面積和產(chǎn)量均居世界前列，2016年我國南瓜栽培面積42.28萬hm2，產(chǎn)量778.94萬t，分別占世界總量的21.6%和29.4%（FAO，F(xiàn)AO-Statistics.www.fao.org/）。南瓜易于管理、種植效益好，是農(nóng)民增收、農(nóng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要支柱，種植面積呈遞增趨勢。但南瓜遺傳育種相關基礎研究起步較晚，遠落后于葫蘆科其他主要瓜類蔬菜，限制了育種技術的提升與產(chǎn)業(yè)發(fā)展。近年來，在科技工作者的努力下南瓜基礎研究取得了一些突破性成果。本文從基因組與轉錄組測序、遺傳圖譜構建與基因/QTLs定位、種質(zhì)遺傳多樣性分析、分子育種等方面進行研究進展概述，并對面臨的問題及發(fā)展趨勢進行展望，旨在為南瓜育種及產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

1 南瓜基因組與轉錄組測序

2017年以來南瓜重要的3個栽培種，印度南瓜（C. maxima）、中國南瓜（C. moschata）與西葫蘆（C. pepo）全基因組從頭測序工作完成并先后釋放（Sun et al.，2017；Montero-Pau et al.，2018），組裝后基因組大小分別為271.4、269.9 Mb和263.0 Mb，各自包含32 076、32 205個和34 240個基因，標志著南瓜遺傳育種與分子生物學研究跨入新的時代，有了高質(zhì)量參考基因組工具。同時，基因組測序還揭示了南瓜異源四倍化事件，并推測葫蘆科內(nèi)屬的分化發(fā)生在3 000萬年前。結合轉錄組數(shù)據(jù)解析了南瓜種間雜種的基因表達變化對雜種優(yōu)勢的貢獻。這些研究結果為多倍體基因組進化模型研究和雜交種親本的選配提供了理論依據(jù)。

轉錄組測序在南瓜上得到了快速應用，除獲得海量序列信息與分子標記外（Wu et al.，2014；王洋洋 等，2016；朱海生 等，2018），也鑒別了一些重要性狀或生物過程相關基因。Blanca等（2011）首次開展西葫蘆轉錄組測序，鑒別參與抗病、開花與果實品質(zhì)形成相關的基因，獲得大量SSR與SNP標記。翌年，Esteras等（2012）利用轉錄組測序構建了西葫蘆第1張高密度遺傳圖譜，并對開花、果實形狀和顏色等性狀進行了QTL分析。Wyatt等（2015，2016）利用轉錄組測序鑒定了參與西葫蘆類胡蘿卜素和碳水化合物代謝的關鍵基因，并認為這些基因的表達調(diào)控是影響果實品質(zhì)的主要因素。王安君等（2016）也開展了中國南瓜與印度南瓜果實中糖、淀粉、類胡蘿卜素和肌醇形成相關差異表達基因的研究。一些參與花形成、低溫脅迫、果實大小與形狀發(fā)育、蚜蟲吸食防御反應及白粉病誘導的基因也在轉錄組水平上進行了挖掘鑒定（Guo et al.，2008； 鐘 玉 娟 等，2015；Xanthopoulou et al.，2015；Vitiello et al.，2016）。

2 遺傳圖譜構建及重要基因/QTLs定位

遺傳圖譜構建及重要基因/QTLs定位是分子育種的基礎。早期，利用同工酶、RAPD與AFLP標記構建南瓜遺傳圖譜，獲得與黃果皮基因B、白斑病基因M、裸仁基因n和小西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV）抗病基因等連鎖的標記，但圖譜標記稀少，性狀與標記連鎖不緊密，標記檢測過程繁瑣或穩(wěn)定性差（Weeden＆Robinson，1986；Lee et al.，1995；Brown ＆ Myers，2002；Zraidi＆ Lelley，2004；Zraidi et al.，2007；陳鳳珍，2008）。Gong 等（2008a，2008b）開發(fā)了大量擴增穩(wěn)定的SSR標記，先后構建了西葫蘆與中國南瓜遺傳圖譜，并揭示了兩者基因組間的線性關系。向成鋼（2013）與Ge等（2015）分別構建了包含SSR 標記的印度南瓜遺傳圖譜，獲得與全綠基因gf和瓜皮色基因Rc遺傳距離6.3 cM和5.9 cM的SSR標記；南瓜粒寬與耐冷性狀也在構建遺傳圖譜后進行了QTL定位（譚行之 等，2013；Xu et al.，2017）。

高通量測序技術為SSR與SNP標記的大量開發(fā)及高密度遺傳圖譜的構建帶來了契機（Esteras et al.，2012）。Zhang等（2015）構建了印度南瓜第1張包含458 個SNPs標記的高密度遺傳圖譜，鑒定了短蔓候選基因Cma_004516。針對果肉淀粉含量、種子粒長、粒寬等性狀也進行了QTL分析（毛曉微，2016）。Montero-Pau等（2017）構建了包含7 718個SNPs標記的西葫蘆連鎖圖，獲得與開花、果實品質(zhì)等性狀相關的QTL位點48個。Zhong等（2017）構建了包含3 470個SNPs標記的中國南瓜遺傳圖譜，將瓜皮色與條紋基因定位在第8連鎖群0.31 cM的區(qū)域內(nèi)，獲得與果實類胡蘿卜素與糖含量、瓜瘤、瓜直徑等12個性狀相關的QTL位點29個。Ka?m iń ska等（2018）構建了包含1 824個標記的印度南瓜遺傳圖譜，獲得3個控制果肉顏色和類胡蘿卜素含量的QTL位點。

另外，趙福寬等（2007）在南瓜上獲得與黃瓜花葉病毒（CMV）抗病基因遺傳距離為7.1 cM的RAPD標記。李云龍等（2007）獲得與中國南瓜短蔓基因遺傳距離為2.9 cM的SCAR標記，王深浩等（2011）進一步將連鎖標記縮近到1.0 cM。Kabelka和Young（2011）獲得與西葫蘆銀葉病抗病基因（sl）遺傳距離3.3 cM 的SSR標記。李智媛等（2011）獲得與西葫蘆裸仁性狀連鎖的SCAR標記。高旭（2014）鑒定了與南瓜耐鹽、耐澇性狀連鎖的RAPD和SSR標記。Pachner等（2015）獲得3個與籽油用西葫蘆ZYMV抗病基因連鎖的SSR與SCAR標記，Capuozzo等（2017）獲得連鎖更為緊密的SNP標記。Kim等（2016）在中國南瓜上開發(fā)了與西瓜花葉病毒（WMV）、ZYMV抗性連鎖的4個RAPD標記，并轉化成功1個SCAR標記。Holdsworth等（2016）將南瓜白粉病抗病基因定位在76.4 kb的區(qū)間內(nèi)。單文琪（2016）獲得與印度南瓜強雌性狀連鎖的分子標記，李海真團隊也將該性狀定位在57.4 kb的區(qū)域內(nèi)（孫劍飛，2018）。周洋洋等（2018）獲得與瓜皮色遺傳距離1.86 cM（145.13 kb）的SNP分子標記，并開發(fā)了2個dCAPS標記。

3 分子標記輔助選擇育種

與南瓜重要性狀連鎖緊密的分子標記較少，且早期多為RAPD或AFLP標記，操作復雜或擴增穩(wěn)定性差，應用困難，加之育種單位間技術發(fā)展不平衡，真正開展分子標記輔助選擇育種的單位較少。Lelley和Henglmuller（2000）利用分子標記進行籽油用西葫蘆ZYMV抗病育種。2010年左右先正達將與抗病基因連鎖的RAPD標記轉化為SNP標記，最早開展KASP高通量標記輔助選擇育種，篩查南瓜白粉病與ZYMV病毒病抗性單株。稍后，北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心李海真團隊也利用自主研發(fā)的SSR標記開展白粉病與病毒病抗性育種（李海真 等，2014），并逐步將短蔓、強雌與南瓜類砧木脫蠟粉等性狀納入分子標記輔助選擇育種技術體系。Pachner等（2015）也利用SCAR和SSR標記進行籽油用西葫蘆ZYMV抗病篩查轉育。

4 遺傳多樣性研究

遺傳多樣性研究可以揭示不同種質(zhì)材料間的遺傳變異程度，為種質(zhì)資源的科學分類及育種選擇提供依據(jù)。早期利用同工酶、RAPD標記、細胞器DNA揭示南瓜3個主要栽培種中，中國南瓜遺傳多樣性與西葫蘆相似，高于印度南瓜（Jobst et al.，1998；Baranek et al.，2000）。Paris等（2003）利用分子標記將45份西葫蘆材料分成3個類群（pepo、ovifera和fraterna），并揭示后兩者親緣關系更近，且栽培種內(nèi)具有豐富的遺傳變異。后來，Gong等（2012）也將100份西葫蘆材料分成這3個類群，并推測聚類在2個栽培種間的4份材料為未被馴化 的 野 生 種。Ferriol等（2003a）、Formisano等（2012）分別利用SRAP、AFLP和EST-SSR標記將西班牙的69份南瓜商品種和地方品種分為2個亞類pepo和ovifera，認為地方品種中存在的豐富有利遺傳變異未被廣泛利用。希臘與南非的西葫蘆地方品種也利用分子標記進行了多樣性分析（Ntuli et al.，2015；Xanthopoulou et al.，2015）。利用RAPD和SBAP標記，F(xiàn)erriol等（2003b）將西班牙的印度南瓜地方品種也分為了3個類群。Ka?m iń ska等（2017）利用SSR標記對85份來源于不同國家的印度南瓜種質(zhì)材料進行了多樣性分析。Kong等（2014）報道砧用南瓜商品種多為印度南瓜與中國南瓜種間雜交種，且砧用中國南瓜自交系間存在可利用的高遺傳變異。Gwanama 等（2000）將非洲中南部31份中國南瓜地方品種劃分為4個類群。Barboza等（2012）分析了中美洲地區(qū)的218份中國南瓜，認為來源于墨西哥的材料較來源于尼加拉瓜、危地馬拉和巴拿馬的材料多樣性更為豐富。

國內(nèi)，Wu等（2011）采用AFLP標記對74份來源于中國、15份來源于其他國家的中國南瓜進行分析，來源于中國的材料被分為2類，與印度和日本的資源相近，明顯有別于墨西哥、危地馬拉、洪都拉斯和厄瓜多爾的資源。李俊麗等（2005）與盧麗芳等（2015）均利用分子標記將南瓜材料分成中國南瓜、印度南瓜與西葫蘆3大類群。云天海等（2013）應用ISSR和SRAP標記對28 份海南南瓜農(nóng)家品種的遺傳特異性進行分析，構建了指紋圖譜。王瑞等（2016）利用SSR標記將95份南瓜材料分成3個類群；王迎兒等（2017）將浙江省41份南瓜材料分成4個類群。另外，南瓜豐富的表型變異特征也被用以種質(zhì)遺傳多樣性研究（Tsivelikas et al.，2009；Balkaya et al.，2010； 楊 正 安 等，2011；屈淑平 等，2013；李鶴 等，2014；郁永明 等，2014；鄭道君 等，2016；Darrudi et al.，2018）。

5 轉基因育種

針對病毒病的嚴重危害，美國1995年釋放了第1個轉ZYMV外殼蛋白基因的西葫蘆抗病品種，翌年又釋放了可以同時抵御ZYMV、WMV和CMV 3種病毒侵害的轉基因西葫蘆品種（Fuchs &Gonsalves，1995；Tricoli et al.，1995；Fuchs et al.，1998），后又培育出抗南瓜花葉病毒（SqMV）的轉基因西葫蘆品種（Provvidenti＆ Tricoli，2002）。Shah等（2008）以西葫蘆莖尖為外植體，同時轉化2個載體，轉化效率為0.7%。Nanasato等（2011，2013）以中國南瓜子葉節(jié)為受體，初始獲得2.7%遺傳轉化效率，后來提高到9.2%，而西葫蘆、印度南瓜與黑籽南瓜的轉化效率較低，僅為 0.2%～0.3%， 但 Ram í rez-Ortega等（2015） 卻在印度南瓜上獲得17.6%～56.0%的高轉化率。國內(nèi)在南瓜轉基因方面也進行了不斷探索。王晶晶等（2007）成功將菜豆幾丁質(zhì)酶基因經(jīng)農(nóng)桿菌介導導入南瓜中。李長生等（2009）對黑籽南瓜農(nóng)桿菌轉化的適宜條件進行了研究。付洪冰等（2010）利用根瘤農(nóng)桿菌侵染南瓜子葉節(jié)，成功獲得轉化率為0.56%的陽性植株。張言朝等（2012）利用子房注射法獲得轉化aiiA基因的陽性株，轉化率為 0.25%。

6 單倍體育種

雙單倍體技術可以顯著提高優(yōu)良株系純化速度，提高育種效率。Chambonnet＆Dumas（1985）培養(yǎng)西葫蘆未受精胚珠，獲得單倍體與二倍體的嵌合植株。隨后，Metwally等（1998）探索了低溫預冷（4 ℃）和培養(yǎng)基處理對開花前1 d胚珠培養(yǎng)的影響，獲得西葫蘆單倍體和雙單倍體植株。同年，Metwally等利用花藥培養(yǎng)也獲得西葫蘆單倍體植株。Shalaby（2007）培養(yǎng)西葫蘆子房切片，再生植株中35%為單倍體，剩余為雙單倍體。Kurtar等（2018）對印度南瓜和中國南瓜進行大孢子培養(yǎng)，可獲得37.7%的雙單倍體誘導率。國內(nèi)很多學者也對大孢子培養(yǎng)獲得單倍體的條件進行了探索，并得到西葫蘆（陳學軍 等，2000；郭永強 等，2004；謝冰 等，2006；徐靜，2007；劉栓桃 等，2008；葛志東，2009）與中國南瓜（翟慶慧，2009；孫守如 等，2013；閔子揚 等，2016）單倍體植株。另外，Kurtar等（2002）、Kurtar和 Balkaya（2010）利用輻射花粉誘導途徑獲得西葫蘆單倍體，誘導率為幼胚的1.17%，Ko?mrlj等（2013）也獲得類似結果。國內(nèi)，許利彩等（2009）和蘇敏等（2011）利用輻射花粉誘導西葫蘆單倍體，獲得5.08%～7.40%的誘導率。單倍體誘導效率及穩(wěn)定性還需進一步提高，同時受體材料基因型間的差異也需克服。

7 存在問題及展望

目前我國南瓜育種基礎研究面臨的主要問題有：研究起步晚，長期投入少，研究深度不夠，創(chuàng)新性不足；各單位發(fā)展不平衡，基礎研究帶來的新技術、新方法在育種上應用少，對育成品種的貢獻率低，還沒有起到引領推動南瓜育種技術提升及產(chǎn)業(yè)發(fā)展的作用。因此，今后應該在以下幾個方面做出努力：

① 加強基因組、轉錄組數(shù)據(jù)的利用。南瓜組學研究還處于發(fā)展初期，海量研究數(shù)據(jù)會不斷涌現(xiàn)，深入開展比較基因組學、結構基因組學、功能基因組學以及轉錄組研究，在基因組水平對種質(zhì)資源進行深入鑒定及對重要功能基因進行快速發(fā)掘，為新品種選育提供指導。

② 加快分子設計育種體系建設，創(chuàng)制突破性南瓜新品種。在重要性狀控制基因不斷發(fā)掘的基礎上加強應用平臺建設，實現(xiàn)分子育種與常規(guī)育種技術的緊密結合，實現(xiàn)優(yōu)良基因的最佳配置，提高多目標性狀同步改良的效率，將傳統(tǒng)育種逐步向現(xiàn)代分子育種轉變，提升我國南瓜育種技術水平，增強國際競爭力，以種質(zhì)資源創(chuàng)新、新品種培育為突破口，為產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供保證。

③ 爭取在單倍體育種與轉基因育種上有所突破。克服目前南瓜雙單倍體誘導及轉基因效率低的問題，實現(xiàn)雙單倍體育種應用，提高優(yōu)良株系純合速度；提高遺傳轉化效率，做好基因工程育種包括基因編輯系統(tǒng)的技術儲備研究。