靈芝三萜液態(tài)深層發(fā)酵的研究進展

翟雙星，馮 杰，馮 娜，唐慶九，周 帥，楊 焱，劉艷芳，張勁松

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所/國家食用菌工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室/國家食用菌加工分中心/上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室，上海201403；2上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234）

0 引言

靈芝又名瑞草、靈芝草，屬多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子實體，是中國著名的藥用真菌，最先記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有扶正固本、滋補強壯、延年益壽、維持機體平衡等功效。已有研究表明，靈芝中含有多種活性成分，如多糖、三萜、甾醇、氨基酸、蛋白質(zhì)、生物堿、揮發(fā)油、維生素及無機元素等[1]?，F(xiàn)如今對于靈芝中的化學(xué)成分研究重點主要集中有不同生物活性的三萜和多糖的上。目前，市場上靈芝多糖相關(guān)產(chǎn)品種類豐富，因為靈芝中三萜成分復(fù)雜難以制備，導(dǎo)致靈芝三萜類的相關(guān)產(chǎn)品較為缺乏，因此吸引許多研究者將注意力集中到靈芝三萜化合物的研究上來。

目前，獲取靈芝三萜的來源主要有兩種：一是從栽培生產(chǎn)出的子實體和靈芝孢子中獲取，二是從發(fā)酵生產(chǎn)出的菌絲體或發(fā)酵液中獲取。由于栽培生產(chǎn)靈芝的周期較長（一般需要4—9個月），并且易受環(huán)境與季節(jié)的影響，導(dǎo)致從子實體中準備的三萜產(chǎn)品的穩(wěn)定性較差，而通過液態(tài)發(fā)酵技術(shù)來獲取靈芝菌絲體則成為制備三萜的更有效的手段[2]。目前，利用發(fā)酵法生產(chǎn)靈芝三萜類的文獻報道有很多，主要包括菌株篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化、分離純化、結(jié)構(gòu)解析、生物活性等方面。至今未見關(guān)于這些研究的系統(tǒng)性總結(jié)的報道。筆者在本研究單位在過去幾十年對靈芝研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合并總結(jié)國內(nèi)外文獻的研究報道報道，對發(fā)酵生產(chǎn)靈芝三萜的研究現(xiàn)狀加以歸類和概括，以期為后續(xù)的研究者提供借鑒和幫助。

1 靈芝三萜的種類和結(jié)構(gòu)

至今為止從靈芝屬中分離得到了300多種三萜類化合物。靈芝三萜類化合物是由異戊二烯單元組成的化合物[3]，絕大部分屬高度氧化的羊毛甾醇衍生物，包括三萜酸、三萜醇類等物質(zhì)。按其碳原子數(shù)目可將其分為三大類，分別為C24、C27、C30型三萜[4]；按其所含功能基團和側(cè)鏈不同有15種骨架，并且其側(cè)鏈長短不一，從2個碳到10個碳不等。靈芝三萜類化合物的不同骨架結(jié)構(gòu)如圖1所示[4]。

2 靈芝三萜的生物活性研究

靈芝三萜具有多種生理活性，主要具有保肝、抗高血壓、抗HIV-1及HIV-l蛋白酶活性、抗氧化、抗腫瘤等重要作用[5-7]。Li等[8]對已受肝損傷的小鼠分別注射10 mg/kg和30 mg/kg的靈芝酸，7天后發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒(HBV)的抑制率比對照分別提高了20%和44%。Weng等[9]研究表明富含靈芝酸的靈芝提取物可作為高侵襲性肝癌細胞腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的化學(xué)預(yù)防劑。劉冬等[10]研究表明靈芝三萜類物質(zhì)對原發(fā)性高血壓大鼠有顯著的降壓作用。郭芳等[11]測定了不同劑量的靈芝發(fā)酵液對大鼠腦組織總抗氧化活力的影響，發(fā)現(xiàn)靈芝發(fā)酵液1.2 g/kg可明顯提高總抗氧化活力。

在過去幾十年中，許多癌癥患者通過使用天然產(chǎn)物作為替代或補充性藥物，以減少或預(yù)防癌癥治療期間或治療之后帶來的副作用，從而改善其生活質(zhì)量。三萜類化合物是靈芝的主要活性成分之一，對其抗腫瘤作用已有廣泛研究。其中，Su等[12]測定了15個靈芝酸三萜化合物對囊腫發(fā)育的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靈芝酸乙酯C2在體外對囊腫的增長具有有效的抑制作用。Liu等[13]發(fā)現(xiàn)靈芝酸DM對PC-3細胞顯示出明顯的細胞毒作用。Shao等[14]研究發(fā)現(xiàn)靈芝酸F，靈芝酸K，靈芝酸B，靈芝酸D和靈芝酸AM1在對HeLa人宮頸癌細胞有抑制作用。

3 靈芝三萜的檢測

目前，靈芝三萜最常用的測定方法主要集中在化學(xué)法和HPLC法，其中化學(xué)法主要是以齊墩果酸或熊果酸為對照品，以5%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸為顯色劑，通過比色法來測定靈芝中總?cè)频暮?。但是由于標準品齊墩果酸與靈芝中三萜成分結(jié)構(gòu)存在差異，并且靈芝中含有較多的干擾物質(zhì)，導(dǎo)致化學(xué)法的測定結(jié)果存在比較大的誤差。而相比于化學(xué)法，HPLC是一個比較精確的含量測定方法，它可以減少干擾物質(zhì)對三萜含量的影響[15]，但是需要對照的標準品。另外由于靈芝中三萜化合物種類豐富，且具有相似的結(jié)構(gòu)特征，也導(dǎo)致開發(fā)準確定量靈芝三萜的HPLC色譜也存在許多困難，，導(dǎo)致了靈芝三萜質(zhì)量標準難以提高。近年來，針對HPLC方法的困難，不同研究者開展了靈芝三萜高效液相測定方法的研究，大部分的研究主要針對靈芝子實體的三萜成分，而對菌絲體三萜成分的研究開展的比較少。賈紅巖等[16]建立了同時測定靈芝子實體中12種三萜成分的高效液相色譜法。Wu等[17]通過HPLC-PAD和HPLC-MS分析了中國15個不同省份的15個樣品。通過HPLC檢測到47種化合物，并對其中42個化合物做出了初步鑒定。丁平等[18]建立了可同時測定6種三萜酸的含量RP-HPLC方法?？傮w來說，使用HPLC對靈芝三萜成分含量檢測已有廣泛研究，但分離效果并不夠理想，或者建立的方法所測成分較少，同時，適用子實體分離的方法并不一定適用菌絲體，因此需要進一步研究。

4 靈芝三萜液態(tài)深層發(fā)酵國內(nèi)研究進展

4.1 靈芝三萜生物合成途徑研究

圖1 靈芝三萜的基本骨架結(jié)構(gòu)

三萜類化合物是靈芝合成的一種具有廣泛的生理作用的化合物。目前，對于靈芝三萜的提取分離以及藥理作用已有廣泛的研究，而對靈芝三萜類化合物的合成代謝途徑研究的較少，并且不夠深入。因此，近年來對于靈芝三萜合成過程中的相關(guān)酶與相關(guān)基因也已成為研究熱點。靈芝三萜化合物的合成途徑現(xiàn)在解析如下圖2[19]。

Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與其他萜類化合物的合成類似，靈芝三萜是由甲羥戊酸生物合成途徑合成的。并通過IPP的逐漸累積，形成GPP，F(xiàn)PP等更高分子的異戊二烯類化合物。Lichtenthaler等[20]發(fā)現(xiàn)在此合成過程中IPP為異戊二烯生物合成的一個重要前體。在此合成過程中，多種酶也參與代謝，其中SQS和LSS是靈芝三萜合成的關(guān)鍵酶，同樣地，F(xiàn)PPS是影響靈芝三萜前體法FPP含量的關(guān)鍵酶[21]。在基因表達分析結(jié)果中可以得出，HMGR與靈芝重要三萜的生物合成呈正相關(guān)[22]，F(xiàn)PPS基因可在菌絲生長階段表達，并且在形成原基后表達量顯著提高[23]。對靈芝的全基因組進行測序得出，編碼細胞色素P450的基因中有78個CYP基因與靈芝三萜重要前體羊毛甾醇的合成酶(LSS)共表達，這提示研究者CYP可能與靈芝三萜的合成有關(guān)[19]。

4.2 靈芝三萜液態(tài)深層發(fā)酵調(diào)控

目前，利用代謝調(diào)控手段提高液態(tài)深層發(fā)酵靈芝三萜的得率是現(xiàn)在研究的一個熱點。在發(fā)酵過程中，通過選擇合適的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的營養(yǎng)因子和環(huán)境因子參數(shù)，或者在發(fā)酵體系中加入外源物質(zhì)等手段都可以用來影響三萜的合成代謝，達到提高靈芝三萜的得率的目的。

4.2.1 靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基

（1）碳源

圖2 靈芝酸的生物合成途徑

靈芝液體深層發(fā)酵常用的碳源主要有葡萄糖、果糖、淀粉、玉米粉、木糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、酒糟等。使用復(fù)合碳源對提高發(fā)酵靈芝多糖和靈芝酸的產(chǎn)量有利[24]。Tang等[25]研究發(fā)現(xiàn)乳糖對菌體生長、靈芝酸和胞內(nèi)多糖的和產(chǎn)生有益。鮑銳等[26]篩選出靈芝發(fā)酵產(chǎn)三萜的最佳碳源為玉米粉。王謙等[27]研究表明，靈芝深層培養(yǎng)的適宜碳源為玉米粉和葡萄糖。Wei等[28]在靈芝發(fā)酵培養(yǎng)中采取蔗糖分批補料方式，在10 L發(fā)酵罐殘?zhí)翘砑恿康陀?5 g/L時添加蔗糖，可使菌絲體生物量、靈芝三萜產(chǎn)量分別提高62%、40%。

（2）氮源

氮作為構(gòu)成生物體的蛋白質(zhì)、核酸及其他含氮化合物的重要成分，是影響細胞生長及代謝的重要因素[29]。因此選擇合適的氮源種類并確定其最佳用量對促進靈芝三萜的合成也至關(guān)重要。一般用到的氮源有酵母粉、蛋白胨、豆餅粉、麩皮、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、谷氨酸等，已有研究發(fā)現(xiàn)靈芝對有機氮源的利用優(yōu)于無機氮源[30]。潘繼紅等[31]對靈芝液體培養(yǎng)營養(yǎng)需求作了探討，篩選后得出黃豆餅粉為靈芝發(fā)酵最適氮源。Liu等[32]通過液體搖瓶發(fā)酵優(yōu)化了靈芝菌株的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件，得出最優(yōu)氮源也為氮源為黃豆餅粉，這與潘繼紅研究一致。馮杰等[33]從硫酸銨、氯化銨、魚粉蛋白胨、胰蛋白胨和酵母粉五種氮源中篩選出酵母粉為滬農(nóng)一號發(fā)酵的最優(yōu)氮源[30]。

（3）無機鹽

靈芝在液體發(fā)酵過程中添加少量的無機鹽有利于目標產(chǎn)物的產(chǎn)生，通常Mg2+、K+和P5+是靈芝菌絲體正常生長的必要條件。其中，磷主要參與糖代謝，鎂離子存在于細胞膜和細胞壁，與碳源的氧化有關(guān)。兩者的用量與菌體生長有著直接的關(guān)系[34]。葉盛權(quán)等[35]在研究了K+、Mg2+和Fe2+對靈芝多糖含量的影響之后發(fā)現(xiàn)添加了Fe2+的發(fā)酵培養(yǎng)基菌絲體的生物量和多糖產(chǎn)量最多，分別為7.299 g/L和0.720 g/L。Xu Y N等[36]在靈芝液態(tài)培養(yǎng)開始時加入10 mmol/L Mn2+后發(fā)現(xiàn)總靈芝酸的產(chǎn)量提高了2.2倍。Li等[37]使用L-谷氨酰胺與CuCl綜合控制策略，得出靈芝三萜的含量為1.87 mg/100 mg，比單獨使用L-谷氨酰胺和CuCl提高了4.2、2.1倍。

（4）維生素

據(jù)報道，在靈芝發(fā)酵培養(yǎng)中添加維生素類物質(zhì)可促進菌絲體的生長，其中VB1的使用最為廣泛，因此諸多研究者選擇添加VB1作為靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基的一種生長因子來促進菌絲體的生物量和活性物質(zhì)的含量，如Tang等[38]在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入了0.05 g/L的VB1，朱會霞等[39]在種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加了1%和0.005%的VB1。并且，VB1的添加量對靈芝發(fā)酵有一定的影響，陳志玲等[40]探究了不同濃度的VB1對靈芝液體發(fā)酵的影響，下發(fā)現(xiàn)當(dāng)VB1添加量為1.0%時，菌絲體內(nèi)三萜含量達到最大，為23.56 mg/g。

4.2.2 發(fā)酵條件

（1）溫度

靈芝液態(tài)發(fā)酵的溫度范圍在22～35℃，較高或較低溫度都不利于菌絲體生長。低溫時，菌絲體生長緩慢，高溫時菌絲容易老化，隨著時間延長菌體逐漸自溶，并且發(fā)酵液顏色加深。不同溫度可影響靈芝中活性成分的產(chǎn)量[1]。李平作等[41]在25 L發(fā)酵罐上對靈芝發(fā)酵產(chǎn)三萜酸的工藝優(yōu)化，得出在溫度為30℃時，靈芝酸的最高產(chǎn)量是0.36 g/L發(fā)酵液。汪金萍等[42]研究5個不同的溫度梯度，得出28℃時更適合靈芝菌絲生長?，F(xiàn)階段，采取變溫策略控制靈芝三萜液體發(fā)酵已成為一種重要手段，本實驗室研究者Feng等[43]建立了一種溫度變換控制策略，分3個階段改變發(fā)酵溫度，分別實現(xiàn)了三萜合成水平、產(chǎn)量和生產(chǎn)率的升高，分別為27.32%，13.94%和37.11%[36]。

（2）培養(yǎng)基pH

pH值可影響代謝途徑中各種酶的活性，是影響真菌菌絲體生長及產(chǎn)物分泌的重要因素。研究pH值在靈芝發(fā)酵過程中的變化規(guī)律，并通過一定方法控制發(fā)酵過程中pH值的變化，對提高靈芝發(fā)酵的靈芝酸的產(chǎn)量具有重要意義。Ling[39]的研究發(fā)現(xiàn)菌絲體生長及胞內(nèi)靈芝酸生成的最適pH 5.5，胞外靈芝酸產(chǎn)生最適pH 4.5。劉冬等[44]認為菌絲體生長及胞內(nèi)多糖產(chǎn)生的最適pH 5.4，胞外多糖產(chǎn)生的最適pH 4.6。Wang等[45]使用響應(yīng)面方法優(yōu)化發(fā)酵的關(guān)鍵條件，得出菌絲體三萜酸的最佳發(fā)酵Ph 6.0。近年來也有研究者采用分階段調(diào)節(jié)pH值對靈芝進行發(fā)酵培養(yǎng)的工作報道，Tang等[46]在發(fā)酵前4天控制pH 3.0，緊接著設(shè)置為pH 4.5繼續(xù)培養(yǎng)6天。得到靈芝酸的產(chǎn)量為321.6 mg/L，這比單獨在pH 3.0和pH 4.5條件下分別提高了50%和300%。

（3）轉(zhuǎn)速

在發(fā)酵過程中攪拌剪切力對靈芝的生長有顯著影響，實驗室搖床培養(yǎng)過程中直接控制攪拌剪切力的途徑即為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，趙娜等[47]在5.5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵靈芝，采用了變轉(zhuǎn)速調(diào)控策略，對振蕩發(fā)酵階段進行優(yōu)化，以期達到高產(chǎn)三萜的目的。振蕩階段最佳條件為轉(zhuǎn)速由150 r/min變?yōu)?00 r/min，該策略與液體靜置培養(yǎng)相結(jié)合，最終菌絲體三萜產(chǎn)量高達678.0 g/L，比優(yōu)化前提高了21%。Feng等[48]開發(fā)了一種簡單且可重現(xiàn)的兩階段轉(zhuǎn)速控制來實現(xiàn)三萜增長的策略，即在第40 h，將攪拌速度控制在150 r/min，隨后將攪拌速度控制在100 r/min，使三萜的最大濃度達到0.086 g/L，產(chǎn)量為6.072 g/kg，生產(chǎn)率為6.532×10-4g/h，相比對照組分別提高了39.61%，36.48%和49.22%。

（4）通氣量

靈芝菌絲體的代謝過程需要消耗氧氣。發(fā)酵中合適的通氣量是確保溶解氧濃度的直接手段，不僅可使細胞在生長時有充足的氧氣，而且會影響菌絲體代謝過程中各種關(guān)鍵酶的活性。因此在靈芝液態(tài)發(fā)酵過程中必須保證穩(wěn)定而合適的溶氧環(huán)境，即穩(wěn)定合適的通氣量[49]。在發(fā)酵初期，菌絲量較少，可使用較低的通氣量。隨著菌絲生長不斷加快，通氣量需加，發(fā)酵后期，菌絲衰老，代謝能力減弱，通氣可適當(dāng)降低[1]。孫金旭等[50]使用正交實驗在10 L發(fā)酵罐上尋找最優(yōu)發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)通氣量為0.4 L/(L·min)時，菌絲體干重和胞內(nèi)三萜達到最大，分別為8.27 g/L和171.27 mg/L。同時，本實驗室研究者在5 L發(fā)酵罐中對靈芝三萜的擴大培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，得出通氣量為8 L/min時，三萜合成得率和生產(chǎn)強度最大[49]。

（5）外源添加物

近幾年，采用外源添加物對靈芝三萜的生物合成進行調(diào)控成為靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵調(diào)控的新策略和新手段。葉麗云等[51]在J-7/AL-2菌株發(fā)酵中，加入10 mmol/L鈣離子誘導(dǎo)，三萜含量提高64%。在發(fā)酵液中加入150 μmol/L水楊酸(SA)誘導(dǎo)，三萜含量提高37.19%。劉高強[52]等在靈芝發(fā)酵中，加入藥用昆蟲蜣螂，在深層發(fā)酵第7天時，靈芝總?cè)频漠a(chǎn)量達到539.0 mg/L。Ren等[53]首次使用茉莉酸甲酯作為靈芝酸的合成誘導(dǎo)劑，結(jié)果表明，在培養(yǎng)第6天向培養(yǎng)基中加入溶解在吐溫-20的茉莉酸甲酯25 μm，靈芝酸A的產(chǎn)量為4.52 mg/100 mg，相比對照組提高了45.3%。Hu等[54]以靈芝生長于木材上為研究靈感，探索木材降解產(chǎn)物對靈芝三萜合成的影響，得出1.5%的微晶纖維素(MCC)和0.5%D-半乳糖分別可使靈芝酸的產(chǎn)量提高85.96%和63.90%。Feng等[48]測試了6種外源性添加劑對靈芝菌絲體生長和三萜生物合成的作用，得出在發(fā)酵第0 h加入30 mL/L的油酸可使三萜產(chǎn)量提高。并且分別搖瓶和5 L發(fā)酵罐中，在發(fā)酵的第25.63 h添加29.85 mL/L的正十二烷，得到靈芝三萜的濃度分別為0.85 g/L和0.88 g/L，相比對照組分別提高了578%和398%[55]。

4.2.3 靈芝菌絲體發(fā)酵動力學(xué)研究 發(fā)酵動力學(xué)研究的是發(fā)酵過程狀態(tài)變量隨發(fā)酵時間變化及控制變量之間的規(guī)律。它可以反映出靈芝發(fā)酵過程中菌絲生長速率、基質(zhì)消耗速率和產(chǎn)物形成速率隨時間變化規(guī)律及三者內(nèi)在關(guān)系。對靈芝的發(fā)酵動力學(xué)進行研究，將有助于幫助人們進一步優(yōu)化和控制發(fā)酵過程。這對三萜發(fā)酵的規(guī)?；l(fā)展意義重大。近年來，諸多研究者對靈芝發(fā)酵動力學(xué)開展了一些研究。王曉玲等[56]在30 L發(fā)酵罐中利用Sigmoid函數(shù)構(gòu)建靈芝胞內(nèi)和胞外三萜酸的結(jié)構(gòu)動力學(xué)模型，得出菌體比生長速度、葡萄糖比消耗速率及胞內(nèi)胞外比合成速率達到最大的時間。連瑞麗等[57]分別在搖瓶和發(fā)酵罐中對靈芝三萜的動力學(xué)特征進行研究，得出菌體生長符合Logistic方程。Zhang等[58]根據(jù)Logistic方程、Luedeking-Piret方程分別探究了菌體生長，多糖合成和葡萄糖消耗的動力學(xué)模型。馮杰等[59]根據(jù)Logistic方程、Luedeking-Piret方程得出得到菌絲體生長、產(chǎn)物靈芝三萜生成和底物總糖消耗的動力學(xué)模型和模型參數(shù)，通過專門設(shè)計的Runge-Kutta遺傳算法優(yōu)化了模型的動力學(xué)參數(shù)[60]，并且發(fā)酵實驗值與模型預(yù)測值能較好地擬合。因此，依靠國內(nèi)外學(xué)者建立起來的靈芝發(fā)酵動力學(xué)模型，有助于幫助我們模擬，優(yōu)化，提高靈芝三萜的生產(chǎn)效率。

5 展望

研究表明靈芝三萜具有廣泛的生理活性，具有廣闊的應(yīng)用前景，現(xiàn)在對靈芝三萜的需求量在不斷增大。因此能夠擺脫自然條件限制的發(fā)酵法生產(chǎn)靈芝三萜的液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)越來越得到大家的關(guān)注，然而至今為止，國內(nèi)外學(xué)者對發(fā)酵法生產(chǎn)靈芝三萜研究遠遠不能滿足生產(chǎn)實際需要，這嚴重的制約了靈芝三萜的應(yīng)用在。目前，在靈芝發(fā)酵法生產(chǎn)三萜的研究方面還存在以下幾個方面的問題：第一，中國靈芝種質(zhì)資源豐富，但未系統(tǒng)性的開展從靈芝種質(zhì)資源中篩選適合發(fā)酵工程生產(chǎn)靈芝三萜菌株的工作。第二，現(xiàn)有的研究主要集中于靈芝子實體三萜化合物的研究方面，對菌絲體中的三萜的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理活性方面的研究仍然缺乏。第三，基于發(fā)酵工程生產(chǎn)靈芝三萜的研究多集中于實驗室規(guī)模，規(guī)?；睦冒l(fā)酵法生產(chǎn)靈芝三萜的工藝研究的仍然較少。第四，靈芝三萜發(fā)酵工藝優(yōu)化時，以生物量和活性成分作為判斷標準的工作比較多，而直接利用活性追蹤的方法優(yōu)化生產(chǎn)工藝的工作尚不多見。因此，需要加強以上4個方面的工作，對以使利用發(fā)酵工程的方法生產(chǎn)靈芝三萜的技術(shù)可以真正用于實際生產(chǎn)中，以解決靈芝三萜難以大量的持續(xù)性獲得難題，為利用靈芝三萜開發(fā)保健品和藥品、打下良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

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