納米羥基磷灰石復(fù)合人工骨材料的研究進(jìn)展*

喬軍杰安帥*程宏飛孫義高

骨移植材料能對(duì)臨床常見的骨壞死、腫瘤、骨質(zhì)疏松、外傷、感染等多種原因?qū)е碌墓侨睋p進(jìn)行填充、提供支持進(jìn)而加速骨缺損愈合。自體骨是臨床最理想的移植材料，但其應(yīng)用常受到供區(qū)局部組織損傷、疼痛、骨量有限等的限制。近年來，材料科學(xué)、組織工程學(xué)和納米技術(shù)等學(xué)科的快速發(fā)展與滲透催生了多種復(fù)合人工骨材料的研發(fā)，合成人工骨、組織工程骨的研究與應(yīng)用已取得突破性進(jìn)展[1]。

羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是天然骨的無機(jī)組分，植入體內(nèi)可與正常骨組織直接連接而無修復(fù)過程中的纖維組織界面形成[2]，并且對(duì)成骨細(xì)胞的黏附、增殖及細(xì)胞外基質(zhì)分泌有促進(jìn)作用；同時(shí)在體內(nèi)能夠進(jìn)行生物降解[3]。以羥基磷灰石為基礎(chǔ)組分所構(gòu)建的復(fù)合材料可基本滿足現(xiàn)有骨組織工程人工骨的條件，但其抗剪切及彎曲能力較弱[4]，現(xiàn)有研究表明，合成HA的特性與其直徑大小密切相關(guān)，粒徑介于1 nm～100 nm的羥基磷灰石晶體與普通HA顆粒相比具有眾多優(yōu)勢(shì)：如高表面積、與自然骨的化學(xué)相似性、比普通HA擁有更高的溶解度和更高的生物活性等[5]，以nHA為基礎(chǔ)組分，復(fù)合生物高分子材料構(gòu)建的支架材料顯示出眾多優(yōu)點(diǎn)：力學(xué)性能逐漸衰減，能匹配新骨形成中所需的漸變的力學(xué)環(huán)境，對(duì)缺損部位能提供良好的力學(xué)支撐，復(fù)合的生物高分子多具有直接或間接的調(diào)節(jié)局部微環(huán)境，加速骨生成的作用；同時(shí)可改變材料的孔徑及孔隙率以更好的吸附生物活性因子或種子細(xì)胞等，因此，復(fù)合納米羥基磷灰石（Nano-hydroxyapatite,nHA）材料的研究主要集中于對(duì) HA力學(xué)性能的改進(jìn)及通過單相或多相復(fù)合使其形成具備一定特殊性能的人工骨。本文主要針對(duì)以nHA為基礎(chǔ)組分構(gòu)建的復(fù)合人工骨的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用作一綜述，并對(duì)未來的研究方向進(jìn)行展望。

1 納米羥基磷灰石支架材料

自然骨由納米低結(jié)晶的磷灰石、微量碳酸鈣及膠原纖維組合形成特殊的空間結(jié)構(gòu)。膠原具有可降解性和低抗原性，從仿生的角度看，nHA與膠原復(fù)合能很好的模擬自然骨的狀態(tài)，因此，膠原被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建骨組織工程支架材料[6]。

Hatakeyama等[7]利用所制備的nHA/豬I型膠原復(fù)合物進(jìn)行人成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在材料上黏附狀態(tài)良好，表型維持穩(wěn)定，同時(shí)堿性磷酸酶（ALP，alkaline phosphatase）、骨鈣蛋白（OC，osteocalcin）等的表達(dá)明顯增加，且表達(dá)量隨培養(yǎng)時(shí)間而逐漸升高。Kikuchi等[8]在兔脛骨節(jié)段性缺損模型修復(fù)中發(fā)現(xiàn)膠原/nHA復(fù)合材料可與骨組織形成鍵性結(jié)合，材料被破骨細(xì)胞逐漸吸收，新骨的形成過程中，無任何毒性、炎癥等不良反應(yīng)發(fā)生，該研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，膠原/nHA復(fù)合材料與骨改建代謝中產(chǎn)生的新生骨間形成的交聯(lián)可以改變材料本身的力學(xué)強(qiáng)度和在體內(nèi)的吸收過程，并在維持復(fù)合材料的強(qiáng)度和形狀中起到關(guān)鍵性作用。

目前研究認(rèn)為以膠原及nHA為基質(zhì)構(gòu)建的人工骨最接近正常骨組織的結(jié)構(gòu)與性能，但是膠原力學(xué)性能相對(duì)較差的特點(diǎn)使復(fù)合結(jié)構(gòu)難以長期維持，這限制了其在人工骨領(lǐng)域的應(yīng)用[9]，所以如何提高二者復(fù)合后的力學(xué)強(qiáng)度將是未來研究的主要方向。

聚乳酸（Polylactic acid,PLA）被美國FDA批準(zhǔn)為生物降解性醫(yī)用材料，是一種具有良好生物相容性和生物降解特性的聚合物，成為當(dāng)前仿生細(xì)胞外基質(zhì)中最受重視的生物材料之一[10]，具有較好的機(jī)械強(qiáng)度、彈性模量和熱成型性。將nHA與PLA復(fù)合可以獲得特定的微觀結(jié)構(gòu)，延緩PLA在體內(nèi)的降解速率并增加材料韌性與組織相容性[11]。Lee等[12]將人骨髓干細(xì)胞（bone marrow stem cell，BMSC）培養(yǎng)于nHA/PLA復(fù)合材料，發(fā)現(xiàn)該材料能誘導(dǎo)BMSC增殖并上調(diào)ALP及OC的表達(dá)，有明顯的促進(jìn)鈣離子礦化作用，從而達(dá)到修復(fù)骨缺損的目的，因此能滿足作為細(xì)胞或細(xì)胞因子等載體材料的要求。nHA/PLA復(fù)合后材料的彈性模量得到明顯提高，其在體內(nèi)抗拉伸、壓縮性能較 nHA單獨(dú)應(yīng)用更佳，同時(shí)其內(nèi)搭載的hMSC也能夠進(jìn)行良好的增殖和分化[13]。盡管復(fù)合材料中PLA降解速率減緩，但仍與成骨速度不相匹配，難以進(jìn)行有效的控制，可能導(dǎo)致材料崩塌，使缺損局部失去力學(xué)支撐。針對(duì)這一問題，PLA/nHA復(fù)合人工骨的研究應(yīng)更著重于其力學(xué)性能的控制。

殼聚糖（chitosan，CS）具有生物相容性、生物降解性和抗菌性，是自然界迄今為止發(fā)現(xiàn)的膳食纖維中唯一帶正電荷的動(dòng)物纖維，因其成孔能力及與負(fù)離子的結(jié)合能力優(yōu)越[14]，引起了人們對(duì)于CS/HA復(fù)合材料的深入研究。體外研究中 nHA-殼聚糖支架材料已經(jīng)被多項(xiàng)研究證實(shí)能誘導(dǎo)MSCs增殖與黏附，促進(jìn)其成骨分化，同時(shí)成骨標(biāo)志物如 I型膠原、Runx-2（Runt-related transcription factor 2）、ALP、OC等的表達(dá)明顯上調(diào)[15]。對(duì)Palazzo等[16]制備的CS/nHA骨軟骨替代材料的研究發(fā)現(xiàn)，該材料具有良好的孔徑結(jié)構(gòu)、孔隙率、骨與軟骨間連接良好，材料可由破骨細(xì)胞吸收而進(jìn)行生物降解。Fan等[17]在 nHA/CS復(fù)合材料中搭載淫羊藿，可明顯促進(jìn)BMSC的增殖和分化。近年來不斷有研究[18]證實(shí)殼聚糖與nHA的復(fù)合物在藥物緩釋的過程中發(fā)揮重要的作用，因此以提升所載藥物緩釋性能為目的，以殼聚糖、納米羥基磷灰石為基礎(chǔ)組分的多相復(fù)合人工骨可能會(huì)成為未來研究的熱點(diǎn)方向。

此外，較常見的高分子支架材料尚有明膠、聚乳酸/乙醇酸共聚物 (PLGA)、聚酰胺（PA，polyamide）等，研究表明：在適宜的溫度條件下，明膠中富含的羧酸根負(fù)離子與HA中的Ca2+可形成豐富的化學(xué)鍵結(jié)合，這種結(jié)合在明膠與nHA的自組裝和生成的過程中發(fā)揮了重要作用[19]。因此nHA/明膠復(fù)合物有望成為骨組織工程材料的研發(fā)新方向。Ji等[20]針對(duì)HA明膠復(fù)合材料的不同形態(tài)對(duì)誘導(dǎo)骨再生能力的研究發(fā)現(xiàn)，球面的復(fù)合材料相較于棒狀材料在體內(nèi)外研究中展示了更好的誘導(dǎo)成骨分化和骨形成能力。朱超等[21]報(bào)道羥基磷灰石膠原海藻酸鈉（Alg/nHAC）可以通過聚集諸如骨誘導(dǎo)蛋白等來影響細(xì)胞的黏附、增殖和分化并進(jìn)一步促進(jìn)成骨。Li等[22]報(bào)道，將nHA與PLGA靜電紡絲納米纖維等復(fù)合，明顯增加了成骨細(xì)胞的黏附、遷移、增殖以及骨祖細(xì)胞的成骨分化能力。此外該材料能明顯減少局部炎癥的發(fā)生，剛好可以彌補(bǔ)單獨(dú)使用PLGA時(shí)所造成的的局限。聚酰胺分子中含有極性酰胺鍵這一特性可使其與nHA間的結(jié)合更加緊密。近來已有學(xué)者發(fā)表采用類似合成材料在人體內(nèi)的研究結(jié)果，Xiong等[23]利用化學(xué)發(fā)泡法制得的nHA/PA66復(fù)合材料，在兔脛骨缺損模型中證實(shí)材料無毒性、無致敏效應(yīng)，同時(shí)可促進(jìn)缺損骨加速愈合，置入人體5年后回顧性研究發(fā)現(xiàn)，置入該材料后傷口愈合良好，無任何不良反應(yīng)，該材料與人體在平均6月后形成堅(jiān)固的骨性融合，1.5年左右完全與宿主骨組織融合。

總之，以納米羥基磷灰石為基礎(chǔ)組分，復(fù)合高分子生物材料構(gòu)建的支架搭載種子細(xì)胞、生物活性因子等所構(gòu)建的人工骨在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)能明顯促進(jìn)骨形成，但其只是最大限度的去模擬自然骨組織，并不具備自然骨的全部性能，因此有學(xué)者建議應(yīng)用兩種或兩種以上物質(zhì)進(jìn)行多相復(fù)合[24]，以形成全方位性能更佳或具備某一特定優(yōu)勢(shì)的人工骨。

2 載藥nHA復(fù)合人工骨

復(fù)合人工骨材料可靶向釋放藥物，因而降低了全身高血藥濃度所帶來的副作用，并提高了所載藥物的生物利用度。利用這一特性，負(fù)載特殊作用藥物的復(fù)合人工骨材料被不斷研發(fā)。目前研究主要集中于抗菌類、抗腫瘤類、抗骨質(zhì)疏松類、載生物活性因子等羥基磷灰石復(fù)合人工骨。

2.1 抗菌nHA復(fù)合人工骨

在諸如急、慢性骨髓炎、化膿性關(guān)節(jié)炎等的治療中，即使在病灶清除術(shù)后局部細(xì)菌仍有一定的幾率存活，因此治療中需要維持局部有效抗生素濃度，而傳統(tǒng)的大劑量長時(shí)間全身應(yīng)用抗生素往往會(huì)造成細(xì)菌耐藥性，嚴(yán)重者可導(dǎo)致全身多個(gè)器官發(fā)生藥物性損傷。

負(fù)載抗菌類藥物的人工骨可在感染骨組織局部形成較高的抗生素濃度，同時(shí)也可對(duì)骨缺損部位進(jìn)行填充提供力學(xué)支撐。多種負(fù)載抗菌藥物的人工骨材料，已經(jīng)被證實(shí)具有顯著的抗菌效應(yīng)[25]?，F(xiàn)有具有抗菌效應(yīng)的nHA復(fù)合人工骨負(fù)載的抗菌物質(zhì)主要可分為抗生素與金屬離子。

2.1.1 載抗生素人工骨材料

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的出現(xiàn)，使得目前骨感染的臨床治療難度明顯加大。目前MRSA已成為外科系統(tǒng)院內(nèi)感染的主要致病菌，而MRAS對(duì)萬古霉素非常敏感。Huang等[26]研究nHA/CS/魔芋甘聚糖/萬古霉素復(fù)合材料在治療金黃色葡萄球菌感染的兔脛骨缺損時(shí)發(fā)現(xiàn)，載抗生素組無明顯感染，炎性指標(biāo)正常，同時(shí)可見缺損局部骨小梁的形成，表明該復(fù)合材料抗菌效果明顯。納米羥基磷灰石作為藥物載體時(shí)，會(huì)不可避免的產(chǎn)生所載藥物前期突釋現(xiàn)象，這就導(dǎo)致抗菌藥物難以在局部形成長期穩(wěn)定的藥物濃度，使其應(yīng)用在一定程度上受到限制。有研究表明[27]，載有四環(huán)素的HA復(fù)合材料，前6天可釋放79.8%的藥物總量，這對(duì)納米羥基磷灰石人工骨藥物緩釋系統(tǒng)及抗生素劑量提出了更高的要求，因此新型人工骨應(yīng)最大限度的將局部藥物濃度控制在較穩(wěn)定的水平，并且尋求最佳的藥物濃度盡可能的減少藥物對(duì)成骨細(xì)胞帶來的影響。近年來，人們將研究側(cè)重于對(duì)羥基磷灰石進(jìn)行多相復(fù)合來調(diào)節(jié)藥物緩釋效應(yīng)。許多高分子材料如PLA、PGA、CS等，在體內(nèi)可逐步降解且對(duì)所載藥物的性質(zhì)影響甚微，而藥物則能在其構(gòu)建的支架系統(tǒng)中能進(jìn)行緩慢釋放。Venkatasubbu等[28]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星/海藻酸鈉/nHA與環(huán)丙沙星/nHA相比，前者具有明顯的緩釋效應(yīng)。由此可見，復(fù)合材料中不同組分會(huì)對(duì)藥物的緩釋產(chǎn)生重要的影響，因此，在保證抗菌性能的基礎(chǔ)上，可選擇性對(duì)人工骨材料進(jìn)行多相復(fù)合以維持藥物的穩(wěn)定性釋放。

2.1.2 載金屬離子人工骨材料

部分重金屬離子具備殺菌能力，金屬離子的加入可以使復(fù)合材料更具有韌性，能夠接受更多的剪切應(yīng)力。目前用于制備人工骨材料的金屬離子有銀、鋅、銅等[29]。Ag+可通過破壞胞膜蛋白質(zhì)而損傷細(xì)胞膜，也可以干擾細(xì)菌DNA合成等達(dá)到滅菌的效果[30]，Ag+因其抑菌范圍廣、抑菌性強(qiáng)、本身毒性低、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn)而廣受青睞。體外研究中，Nath S等[31]通過燒結(jié)法構(gòu)建的10wt%Ag+、HA的復(fù)合物與單純HA相比并不影響細(xì)胞增殖及細(xì)胞間黏附能力，而骨礦物沉積率更高。Saravanan等[32]通過冷凍干燥法制得CS/nHA/Ag+復(fù)合材料，在體外針對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示載Ag+組抑菌效果明顯，進(jìn)一步研究顯示實(shí)驗(yàn)組材料可對(duì)Ag+進(jìn)行緩釋控制，且該過程與新生骨組織長入大致相匹配。但載金屬離子的復(fù)合材料在體內(nèi)應(yīng)用研究較少，仍處于進(jìn)一步的研究與探索中，重金屬離子的不當(dāng)應(yīng)用會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，同時(shí)不當(dāng)?shù)募庸み^程也會(huì)污染環(huán)境，因此，未來針對(duì)該種材料的改進(jìn)應(yīng)主要集中于金屬離子的種類、劑量等，此外局部緩釋及材料的加工過程也應(yīng)有更好的認(rèn)識(shí)與研究。

2.2 抗腫瘤nHA復(fù)合人工骨

對(duì)于骨腫瘤患者，病灶切除會(huì)造成局部骨組織缺損，術(shù)后全身化療藥物的應(yīng)用因藥物嚴(yán)重的毒副作用，可導(dǎo)致全身肝、腎等重要臟器損害，負(fù)載抗腫瘤藥物的人工骨因其全身血藥濃度較低，同時(shí)化療藥物局部高濃度更有利于殺滅腫瘤細(xì)胞，理論上可以較好解決腫瘤術(shù)后骨缺損及進(jìn)一步的抗腫瘤治療。近年來不斷有報(bào)道認(rèn)為納米羥基磷灰石本身具有一定的抗腫瘤效應(yīng)，分析其原理[3]可能為：HA改變胞膜的通透性致其鈣離子過多攝入進(jìn)而出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞鈣超載；影響腫瘤細(xì)胞核酸的合成，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯促進(jìn)腫瘤凋亡；降低腫瘤細(xì)胞的端粒酶的水平。Kamitakahara等[33]結(jié)合HA自身抗腫瘤效應(yīng)及針對(duì)骨腫瘤的熱療，成功構(gòu)建了HA球形多孔支架材料，內(nèi)置磁性納米粒子在骨腫瘤缺損局部交變磁場(chǎng)中可產(chǎn)生高溫進(jìn)而殺滅術(shù)后殘存的癌細(xì)胞。然而該材料也有相應(yīng)的缺點(diǎn)，由于局部產(chǎn)生高溫，因此不可避免的會(huì)損傷正常骨組織，因此需對(duì)所施加交變磁場(chǎng)的強(qiáng)度以及內(nèi)部磁性納米粒子的量進(jìn)行更為精確的調(diào)控。Andronescu等[34]通過冷凍干燥法制得的膠原-羥基磷灰石/順鉑人工骨材料在體外實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)對(duì) G292骨肉瘤細(xì)胞有明確的細(xì)胞毒性，并可明顯抑制腫瘤細(xì)胞再生并降低其侵襲能力，是一種針對(duì)骨腫瘤可行的局部化療載藥人工骨系統(tǒng)，但其研究缺乏進(jìn)一步的體內(nèi)研究，尚無法證明該種材料是否能夠促進(jìn)腫瘤局部新骨生成，或?qū)χ車＝M織有無干擾作用。

2.3 抗骨質(zhì)疏松nHA復(fù)合人工骨

此外，也有研究將復(fù)合羥基磷灰石材料用于治療骨質(zhì)疏松。Shi等[35]在PLGA/HA中載入阿侖膦酸鈉，研究證實(shí)該復(fù)合材料中阿倫磷酸鈉緩釋良好，并明顯上調(diào)ALP的水平并增加了成骨細(xì)胞增殖。Asahina等[36]構(gòu)建的RIS/ZnHA復(fù)合材料能有效的提升大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的骨量，并且進(jìn)一步證明該種復(fù)合材料較RIS單獨(dú)治療OP更具有優(yōu)勢(shì)。

3 載生物活性因子nHA復(fù)合人工骨

骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenetic protein,BMP)是一種存在于骨基質(zhì)中的酸性多肽類物質(zhì)，可以誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及未分化的間充質(zhì)細(xì)胞（mesenchymalstem cell，MSC）向成軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。BMP已被成功用于骨折、骨延遲愈合以及骨缺損的治療。因此，BMP與支架材料進(jìn)行復(fù)合便具有既能填充缺損局部進(jìn)行力學(xué)支撐，又能加速骨愈合的優(yōu)勢(shì)。Asahina等[35]制備得到HA/BMP復(fù)合物，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步表明該材料骨誘導(dǎo)活性比單純羥基磷灰石和HA/膠原復(fù)合材料都要高。此外，Lee等[37]證實(shí)利用納米羥基磷灰石作為支架材料，能對(duì)BMP等的緩釋有更好的控制。Hannink等[38]構(gòu)建了不同載BMP緩釋模型并比較了TCP/HACol+BMP與TCP/HAHep+BMP兩種材料之間的異同，分析認(rèn)為前者能更好的控制BMP的緩釋，直到3周時(shí)仍有BMP釋放，而后者在2周的時(shí)候BMP已經(jīng)全部釋放。值得提出的是，與載抗生素人工骨相似，載生物活性因子時(shí)采用何種支架材料能盡可能的減少對(duì)所載因子的作用的干擾以及控制釋放過程仍值得進(jìn)一步的研究與探索。

總之，雖然針對(duì)nHA復(fù)合人工骨的研究已取得突破性的進(jìn)展，但現(xiàn)有材料仍存在許多問題：如材料的降解速率與成骨速度不相協(xié)調(diào)，部分合成的HA的表面活性相對(duì)較差而影響負(fù)載種子細(xì)胞成活及細(xì)胞因子的黏附、分布，此外不少材料仍會(huì)引起機(jī)體炎性反應(yīng)等。

隨著組織工程學(xué)、材料科學(xué)、分子生物工程技術(shù)等的發(fā)展及各學(xué)科間的滲透、協(xié)作，復(fù)合人工骨材料的研究必然將迎來更迅猛的發(fā)展。未來針對(duì)納米羥基磷灰石復(fù)合人工骨的研究可能集中于以下幾個(gè)方面：通過對(duì)HA孔隙率及孔徑大小等的控制改善基質(zhì)材料的生物力學(xué)性能和物理特性；著重于人工骨材料的生物相容性，加強(qiáng)nHA與生物活性物質(zhì)的親和力；著重所載藥物緩釋的緩釋控制，優(yōu)化復(fù)合材料的降解速率，使其與成骨速度相匹配；尋求生物活性物質(zhì)的最優(yōu)選擇與及各物質(zhì)間的最佳搭配等。

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