一例頑同性奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定

陳云政

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖中最常見多發(fā)的一種乳腺疾病，發(fā)病率高，危害極其嚴(yán)重，是造成奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的四大疾病之一。患病牛主要臨床表現(xiàn)為產(chǎn)奶量減少、擠奶時明顯疼痛甚至拒絕擠奶。奶牛乳房炎是全世界奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的障礙，不僅使得奶牛發(fā)病后造成泌乳機(jī)能不同程度地下降，還對乳品質(zhì)產(chǎn)生影響，甚至對人類的健康也帶來潛在的威脅。據(jù)統(tǒng)計我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)中乳房炎發(fā)病率在15%～40%左右，故對奶牛乳房炎必須予以重視，養(yǎng)殖場應(yīng)加強(qiáng)防范和治療。奶牛乳房炎的病因很多，但與養(yǎng)殖環(huán)境中的病原微生物的侵入有直接的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺炎主要發(fā)病原因是由鏈球菌、葡萄球菌和大腸桿菌等條件性致病菌引起的；此外氣候變更、外力及遺傳因素等都對乳房炎的誘發(fā)有一定的影響，如寒冷陰濕的季節(jié)發(fā)生率較高。本研究對2016年5月本地區(qū)某規(guī)模荷斯坦奶牛場患乳房炎的奶牛經(jīng)治療后仍未痊愈的奶牛病例的鮮奶樣品中的病原菌進(jìn)行了分離和鑒定，以期了解頑固病牛的病原菌感染情況，為尋找有效的治療及控制奶牛乳房炎的發(fā)生提供科學(xué)的依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

采自當(dāng)?shù)啬衬膛龌既榉垦?、有臨床癥狀且已經(jīng)局部和全身用藥治療但體溫仍偏高、泌乳量明顯少的泌乳奶牛乳區(qū)收集乳樣，同時收集健康乳區(qū)乳樣進(jìn)行對照。

1.2主要試劑與儀器

麥康凱培養(yǎng)基、含4%牛血清及0.1%裂解血的培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基（包括7.5%甘露醇NaCl瓊脂、S.S.瓊脂、伊紅美蘭瓊脂等）、PCR Mix、16S通用引物、生化反應(yīng)管；電熱恒溫培養(yǎng)箱、DYY-6C型電泳儀、PCR儀、凝膠成像儀等。

1.3乳樣的采集及處理

采集乳樣前應(yīng)先將乳區(qū)及操作人員手部徹底消毒后，棄去前面流出的乳汁，然后在無菌乳區(qū)采集50mL左右的鮮乳置于無菌的離心管中并作好標(biāo)記，低溫保存并快速送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

1.4乳樣細(xì)菌培養(yǎng)

無菌環(huán)境下將病牛和健康牛的乳樣分別涂在麥康凱培養(yǎng)基、含4%牛血清及0.1%裂解血的培養(yǎng)基及各種選擇培養(yǎng)基上后，將各培養(yǎng)基置于37～C電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察各培養(yǎng)基表面細(xì)菌的生長情況；

1.5菌落PCR鑒定及生化反應(yīng)試驗(yàn)

將含4%牛血清及0.1%裂解血的培養(yǎng)基及各種選擇培養(yǎng)基上的菌落溶解于無菌的生理鹽水中，煮沸10min后，應(yīng)用16S通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增的目的片段與預(yù)期的大小一致。將其送到上海生工測序，將測序結(jié)果與NCBI上公布的序列進(jìn)行比對。將測序比對結(jié)果為葡萄球菌的接種于各生化反應(yīng)發(fā)酵管，培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。

2細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

從兩份乳樣麥康凱培養(yǎng)基上均可見有磚紅色，圓形凸起的菌落，由此可見乳樣中均含有大腸桿菌；含4%牛血清及0.1%裂解血的培養(yǎng)基及各種選擇培養(yǎng)基上的菌落經(jīng)16S PCR鑒定、序列比對及葡萄球菌生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果顯示兩份乳樣中共分離出細(xì)菌2種，其中葡萄球菌屬細(xì)菌共有5株，以金黃色葡萄球菌最多。

3小結(jié)與討論

本次試驗(yàn)因病料采集數(shù)量有限，因此分離出的細(xì)菌種類及數(shù)量均不是很多，同時當(dāng)前仍有很多細(xì)菌不能通過細(xì)菌培養(yǎng)的方式獲得，故存在部分致病菌的遺漏不能檢出。為全面獲得致病菌信息，在牛乳房炎的診治過程中，可考慮應(yīng)用多重PCR及高通量測序進(jìn)行鑒別。通常健康牛乳和患乳房炎病牛分泌的乳汁中細(xì)菌種類很多，但最常見乳房炎致病菌是大腸桿菌、乳房鏈球菌、克雷伯氏菌等，其次是停乳鏈球菌、化膿桿菌、金黃色葡萄球菌等，研究發(fā)現(xiàn)在健康或亞臨床乳樣中乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌含量低于臨床型乳房炎，且健康乳樣中不含有大腸桿菌。但本次試驗(yàn)在健康牛乳對照中也分離到了大腸桿菌，而乳房炎常見的病原菌如鏈球菌等均沒有分離到，分析原因可能是由于單純從臨床癥狀來判定是否患有乳房炎而導(dǎo)致，缺乏SCC等方法對隱性乳房炎的排除等。

奶牛乳房炎的危害性大、治愈困難，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)堅持以“預(yù)防為主、早發(fā)現(xiàn)早治療”的原則預(yù)防控制乳房炎。奶牛乳房炎按臨床表現(xiàn)可分為急性型奶牛乳房炎、慢性型奶牛乳房炎和隱性乳房炎三種，及時治療是急性型乳房炎和慢性型乳房炎的關(guān)鍵措施，而隱性乳房炎應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)控制和預(yù)防工作。調(diào)查發(fā)現(xiàn)在各大養(yǎng)牛場中隱性乳腺炎普遍存在，其發(fā)病率可高達(dá)60%，隱性病例如不及時診治，易轉(zhuǎn)變成臨床型乳腺炎，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此加強(qiáng)做好隱I生感染病例的診治預(yù)防工作，可以從根源上減少和杜絕致病微生物的存在，具有極為重要的現(xiàn)實(shí)意義。奶牛乳房炎絕大多數(shù)都是因?yàn)槿閰^(qū)感染致病細(xì)菌而導(dǎo)致，因此奶牛乳房炎防控應(yīng)從飼養(yǎng)環(huán)境、病原菌來源等基本環(huán)節(jié)進(jìn)行人工干預(yù)，如牛床設(shè)計合理、保持牛舍的環(huán)境衛(wèi)生、及時更換墊料和清理污水糞便、定期消毒等，通過加強(qiáng)牛群的飼養(yǎng)管理、凈化環(huán)境、補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)、增強(qiáng)機(jī)體抗病力、淘汰陽性奶牛及加強(qiáng)疫苗免疫等措施降低乳腺炎的發(fā)生。對于微生物感染引發(fā)的乳腺炎在診治時應(yīng)有針對性地選擇藥物和投藥方法，有條件的養(yǎng)殖場最好先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)來篩選最佳藥物進(jìn)行有效快速的治療。奶牛發(fā)生乳腺炎會直接影響乳汁品質(zhì)，人類飲用后也會影響到人類的身體健康，對公共衛(wèi)生造成一定的威脅。應(yīng)及時淘汰慢性或久治不愈的奶牛，防止病原微生物擴(kuò)散，消除傳染源，因此養(yǎng)牛場應(yīng)定期進(jìn)行全場牛群乳房炎檢測工作及建立健全科學(xué)的疫病防御體系及檢疫制度，以便及時了解該病的流行情況，并提前提高奶牛的自然抗病能力，顯著降低乳房炎發(fā)病率。endprint