升脾顆粒中柚皮苷和新橙皮苷的含量測定

沈震亞（江中藥業(yè)股份有限公司 南昌330046）

升脾顆粒收載于《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》內(nèi)科脾胃分冊，處方由黃芪、黨參、枳殼、白術(shù)和升麻組成，功能升陽益氣。用于氣虛下陷、勞傷虛損引起的胃下垂、子宮下垂、脫肛等癥。枳殼為方中主藥，主要含黃酮類、揮發(fā)油、生物堿、香豆素及三萜皂苷類等成分[1]，具理氣寬中、行滯消脹的功效，用于胸脅氣滯、食積不化、臟器下垂等[2]，原收載標(biāo)準(zhǔn)中僅對其主要特征成分之一柚皮苷進行了含量測定，2015版《中國藥典》中規(guī)定了枳殼藥材中柚皮苷和新橙皮苷的含量測定方法及限度。因此，為了提高本產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，我們對升脾顆粒中柚皮苷和新橙皮苷的含量測定進行了方法學(xué)研究，建立了升脾顆粒中柚皮苷和新橙皮苷的含量測定方法?，F(xiàn)報告如下：

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AD高效液相色譜儀（LC-solution工作站，LC-20AD二元泵，SPD-20A紫外檢測器），CQ-250超聲波清洗器（上海船舶電子設(shè)備研究所），Simplicity TM型超純水系統(tǒng)（Millipore中國有限公司），AG-135電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）。

1.2 材料 柚皮苷對照品（含量測定用，批號：110722-201613，中國食品藥品檢定研究院）；新橙皮苷對照品（含量測定用，批號：111857-201102，中國食品藥品檢定研究院）；升脾顆粒（批號：161201、161202、161203、170101、170102、170103，自制）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Dikma Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈－0.1%磷酸（22∶78）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：283 nm，柱溫：30℃。

2.2 對照品溶液制備 取柚皮苷和新橙皮苷對照品各約10 mg，精密稱定，加甲醇使之溶解并稀釋成每1 ml含柚皮苷30.06 μg和新橙皮苷32.07 μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取本品研細，取0.30 g，精密稱定，置25 ml容量瓶中，加甲醇至近刻度，超聲處理30 min，放冷，補足甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用微孔濾膜（孔徑0.45 μm）濾過，即得。

2.4 陰性對照溶液制備 取未加枳殼的其余藥材按供試品制法制成陰性對照樣品，取0.30 g，精密稱定，按2.3項下供試品溶液制備方法制備，即得。

2.5 陰性對照試驗 在2.1的色譜條件下，柚皮苷和新橙皮苷與其他色譜峰的分離效果均較好，且與陰性對照溶液進樣后無干擾，說明處方中其余各味藥對這兩種成分的檢測無干擾。見圖1。

圖1 對照品溶液-供試品溶液-陰性對照溶液色譜圖

2.6 線性范圍 取柚皮苷和新橙皮苷對照品各約10 mg，精密稱定，加甲醇使之溶解并稀釋成每1 ml含柚皮苷0.300 6 mg和新橙皮苷0.320 7 mg的混合對照品儲備液，將儲備液加甲醇分別稀釋至2、2.5、5、10、12.5、25 倍量體積的不同濃度的混合對照品溶液。分別吸取各濃度的混合對照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀中。以對照品濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（mAU）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得回歸方程。柚皮苷：Y=1 849.799 65X+1 905.716 2，r=0.999 9；新橙皮苷：Y=2381.575214X＋715.34234，r=0.999 9，表明柚皮苷在濃度 12.024～150.3 μg/ml、新橙皮苷在濃度12.828～160.35 μg/ml范圍內(nèi)，其進樣濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.7 精密度試驗 精密吸取每1 ml含柚皮苷30.06 μg和新橙皮苷32.07 μg的混合對照品溶液10 μl，按2.1所述色譜條件重復(fù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果顯示柚皮苷和新橙皮苷峰面積值的RSD分別為1.31%和1.12%（n=6）。表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μl，于 0、1、2、4、6、8、12 h 分別進樣 1 次，測定峰面積。結(jié)果顯示，供試品中柚皮苷和新橙皮苷的峰面積RSD分別為1.48%和1.29%。表明在12 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗 取同一批號制劑6份，照2.3項下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，測定并計算含量。結(jié)果顯示，柚皮苷和新橙皮苷的含量RSD分別為0.96%和1.95%（n=6）。

2.10 加樣回收率試驗 取已知含量的本品適量，研細，取約0.15 g，共6份，精密稱定，分別置于25 ml的容量瓶中，分別精密加入每1 ml含0.100 2 mg柚皮苷和0.106 9 mg新橙皮苷的混合對照品溶液3 ml，加甲醇至近刻度，按2.3項的方法制備成加樣回收樣品溶液。進樣10 μl進行測定并計算回收率，柚皮苷與新橙皮苷的平均回收率分別為100.90%和101.10%，RSD分別為1.63%和1.89%。見表1。

表1 回收率測定結(jié)果

2.11 樣品含量測定 取批號為161201、161202、161203、170101、170102、170103 的升脾顆粒，按 2.3項所述方法制備成供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀中，測定。見表2。

表2 6批制劑中柚皮苷和新橙皮苷含量結(jié)果（mg/袋）

3 討論

根據(jù)《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》辨證分型，“內(nèi)臟下垂”屬中氣下陷[3]。中醫(yī)認為脾氣有開發(fā)之性，若脾虛升舉無力，會引起中氣下陷，故臨床對氣虛下陷所致的內(nèi)臟下垂往往從脾論治[4]。枳殼功能理氣寬中、行滯消脹，是臨床調(diào)理脾胃的常用中藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，枳殼對不同機體狀態(tài)下的胃腸平滑肌肌張力有雙向調(diào)節(jié)作用，楊武亮等[5]通過對枳殼提取物的活性跟蹤發(fā)現(xiàn)，其不同劑量的氯仿提取部位對正常小鼠的胃腸運動分別起到促進和抑制作用，并且經(jīng)臨床證實枳殼煎劑對因胃平滑肌松弛、張力下降所致的胃下垂患者具有良好的治療效果[6]。枳殼主要含黃酮類、揮發(fā)油、生物堿、香豆素及三萜皂苷類等成分，二氫黃酮、黃酮和多甲氧基黃酮等黃酮類成分為其特征成分，包括柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陳皮素和紅菊素等，其中以二氫黃酮類的柚皮苷和新橙皮苷含量最高[5～7]。本制劑主要功效為升陽舉陷，因此選取對臟器下垂有治療作用的枳殼中的柚皮苷和新橙皮苷進行含量測定合理有效。

預(yù)試驗方法研究中，參考2015版《中國藥典》中枳殼藥材的含量測定方法[2]，選取甲醇作為提取溶劑，先后比較了回流與超聲處理不同提取方法對樣品檢出的影響，發(fā)現(xiàn)不同的提取方法對該兩種成分的提取效果無明顯差異；同時分別對超聲提取用15 ml、25 ml和 50 ml甲醇和超聲提取 20 min、30 min、45 min和60 min的效果進行了考察，最終確定以甲醇25 ml超聲提取30 min的提取效果佳，且操作簡便、經(jīng)濟可行。結(jié)合以上方法學(xué)考察的結(jié)果，最終建立了升脾顆粒中柚皮苷和新橙皮苷的含量測定方法。

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