p14基因啟動子甲基化在上皮性卵巢癌臨床檢測中的意義

丁紅巖 高金瑜# 張燕 李長華 孫廣琴

（1南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安一院 江蘇淮安223300；2山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 濟(jì)南250021）

卵巢癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，其死亡率居?jì)D科惡性腫瘤第1位。抑癌基因的失活是卵巢癌發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵因素，其主要表現(xiàn)有基因突變、缺失以及啟動子區(qū)域（CPG島）的過甲基化。p14是細(xì)胞周期調(diào)控因子，通過MDM2-p53通路履行調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程的職責(zé)。上皮性卵巢癌中的表達(dá)異常是否由p14基因啟動子的甲基化所致，尚未見報道。本文旨在探討p14基因啟動子甲基化在上皮性卵巢癌中的存在情況，同時檢測p14基因的突變情況，觀察其與p14甲基化的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007年9月～2009年6月我院收治的45例上皮性卵巢癌患者、30例卵巢良性腫瘤患者及20例卵巢組織正常者作為研究對象，所有患者的病理診斷及組織分級明確，術(shù)前均未進(jìn)行任何化療或放療等治療。上皮性卵巢癌患者中，根據(jù)細(xì)胞分化程度有14例高分化癌，18例中分化癌，13例低分化癌；平均年齡（45.5±6.2）歲；25例漿液性囊腺癌，13例黏液性囊腺癌，6例子宮內(nèi)膜樣癌，1例透明細(xì)胞癌。卵巢良性腫瘤患者中，有17例漿液性囊腺瘤，13例黏液性囊腺瘤；平均年齡（44.9±5.1）歲。卵巢組織正?；颊呔鶠閷m頸良性病變者，患者平均年齡（46.7±5.2）歲。三組患者的一般資料相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，具有可比性。所有手術(shù)標(biāo)本的采集均已得到患者的同意并簽署知情同意書，標(biāo)本切除后立即－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 甲基化特異性PCR檢測

1.2.1 組織DNA提取 組織DNA的提取采用酚-氯仿-異戊醇法，之后通過紫外分光光度法進(jìn)行組織DNA濃度及純度的檢測。

1.2.2 DNA修飾及純化 取 2 μg DNA、3 mol/L NaOH 5 μl加入到50 μl療效反應(yīng)體系中，充分混勻后于75℃反應(yīng)15 min，隨后加入4.8 mol/L亞硫酸氫鈉（購自Sigma公司）320 μl和20 mmol/L的氫醌12.6 μl，充分混勻后再加入 10 μl礦物油，于 55 ℃中水浴過夜。另外，將1 ml DNA純化樹脂（購自Promega公司）加入到每個DNA樣本中，通過純化柱，再加入80%異丙醇溶解樹脂2 ml、NaOH脫硫3 mol/L 5 μl、醋酸鈉 5 mol/L 5 μl，用 100%冰乙醇進(jìn)行DNA沉淀，75%乙醇吹洗，離心，棄上清液，隨后溶于30 μl TE緩沖液中進(jìn)行備用。

1.2.3 甲基化特異PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系共25 μl，主要有 DNA 2 μl、10×PCR buffer 2.5 μl、引物 0.5 μl、dNT 2 μl，Taq 酶 0.2 μl，雙蒸水補(bǔ)足至 25 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃反應(yīng)30 s，57℃退火 45 s，72℃反應(yīng) 30 s，35 個循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。注意非甲基化反應(yīng)退火溫度為54℃。以甲基轉(zhuǎn)移酶SssI處理和未處理的正常人外周血細(xì)胞DNA為陽性和陰性對照，空白對照采用雙蒸水。甲基化引物序列：上游引物F5'-GGT ATA TTT TCG AGG GGT ACG-3'，R5'-TTC CCG ACC CGC ACT CCG C-3'，預(yù)期產(chǎn)物為90 bp；非甲基化引物序列如下：F5'-TGT GAG GGT ATA TTT TTG AGG GGT AT-3'，R5'-CTT CTC TCT CCA CTT CCC AAC CCA-3'，預(yù)期產(chǎn)物為109 bp，由上海生工合成。

1.2.4 電泳 取5 μlPCR產(chǎn)物，采用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測組織標(biāo)本p14mRNA表達(dá) 采用SYBR Green熒光染料進(jìn)行FQ-PCR：（1）按Trizol試劑說明提取組織總RNA；（2）引物序列：p14mRNA：F5'-GAG ACA GAA TGG AGG TGC TGC-3'，R5'-GTA AGA TGA TTG GAA TTA TCTTCT-3'， 預(yù) 期 產(chǎn) 物 為 170bp；GAPDHmRNA：F5'-AAC GGA TTT GGT CGT ATT GGG-3'，R5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCGC-3'，預(yù)期產(chǎn)物233 bp，由上海生工合成：逆轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA 合成：取總 RNA 10 μl，Oligo（dT）5 pmols，65℃ 5 min之后插入冰中，加入 5× Buffer 4 μl，10 mmolPL dNTPs 2 μl，MMLV 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 100 U，RNase抑制劑 20 U，加 DEPC 水至 20 μl，42 ℃ 1 h；FQ-PCR 反應(yīng)體系為 25 μl，其中包含 0.7 μl SYBR Green染料，Mg2+濃度為3.5 mol/L，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性 5 min，95℃反應(yīng) 30 s，56℃復(fù)性 30 s，72℃延伸30 s，共50個循環(huán)后，72℃延伸7 min，每樣本4個復(fù)孔，在CFD-3220 DNA Engine Option自動熒光PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。

1.4 p14基因蛋白表達(dá)的檢測 p14即用型多克隆抗體（購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）、第一抗體兔抗人p14多克隆抗體、第二抗體超敏鏈酶卵白素-過氧化酶（S-P）試劑盒和DAB顯色試劑盒均為即用型。提取卵巢癌組織、良性腫瘤組織和正常卵巢組織的蛋白。采用免疫組織化學(xué)法檢測p14蛋白的表達(dá)，具體方法為：將切片脫蠟至水，于3%過氧化氫甲醇液中37℃孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物活性。以1∶10稀釋的抗原修復(fù)液高溫修復(fù)，加一抗室溫下孵育60 min，加生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育20 min，加S-P溶液37℃孵育30 min。DAB顯色，顯微鏡下觀察3～10 min，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。

1.5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 在400倍顯微鏡下觀察患者標(biāo)本中p14蛋白表達(dá)的情況，其中陽性表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞核和（或）胞漿為棕黃色顆粒。觀察時，每張切片均選定10個觀察視野，每個視野以100個細(xì)胞計(jì)數(shù)。陰性：細(xì)胞數(shù)＜5%，以“－”表示；弱陽性：細(xì)胞數(shù)為5%～25%，以“＋”表示；中等強(qiáng)度：陽性細(xì)胞數(shù)為25%～50%，以“＋＋”表示；強(qiáng)陽性：細(xì)胞數(shù)＞50%，以“＋＋＋”表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，甲基化頻率等計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及Fisher檢驗(yàn)，各組患者蛋白相對含量等計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者p14基因甲基化情況分析 所有患者中均未發(fā)現(xiàn)p14的高甲基化。見圖1。

圖1 p14基因甲基化情況

2.2 p14mRNA表達(dá)水平 p14mRNA在正常卵巢組織中的水平為（0.57±0.41），在卵巢癌組織的水平為（0.83±0.07），在良性腫瘤組織中的水平為（0.62±0.39）。p14mRNA在卵巢癌組織中的水平與正常組織和良性腫瘤組織中的相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；p14mRNA在正常組織和良性腫瘤組織中的水平相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。

2.3 p14蛋白的表達(dá)變化 p14蛋白表達(dá)在上皮性卵巢癌、良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中的陽性率分別為37.8%、73.3%和85.0%，三組中p14蛋白表達(dá)的陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。p14蛋白在13例G3病例中只有3例陽性，陽性率為23.1%；18例G2病例中6例陽性，陽性率為33.3%；14例G1病例中8例陽性，陽性率為57.1%。卵巢癌Ⅰ～Ⅱ期p14蛋白陽性表達(dá)率為40.0%、Ⅲ期p14蛋白陽性表達(dá)率為37.5%和Ⅳ期p14蛋白陽性表達(dá)率為33.3%，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。見表1。

表1 卵巢腫瘤中p14蛋白表達(dá)情況分析

3 討論

在正常細(xì)胞中，p14基因參與細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的調(diào)控，其產(chǎn)物p14蛋白可與MDM2-P53結(jié)合產(chǎn)生P53-MDM2-ARF三聚體復(fù)合物，阻斷MDM2誘導(dǎo)的p53蛋白降解，將p53蛋白的半衰期延長至15～75 min，使p53發(fā)揮門衛(wèi)作用，調(diào)控細(xì)胞周期，誘導(dǎo)周期停滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生。甲基化是抑癌基因失活的機(jī)制之一，主要是胞嘧啶-磷酸 -鳥嘌呤（Cytosine-phosphate-Guanosine，CpG）二核苷酸發(fā)生甲基化，甲基化后抑癌基因不表達(dá)，這可能是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制之一，在某些情況下可能是唯一機(jī)制[1]。p14基因表達(dá)異常包含遺傳學(xué)層面（基因突變和缺失）和表觀遺傳學(xué)層面（DNA甲基化）的。p14異常表達(dá)可表現(xiàn)為高度甲基化，這可能是p14-p53作用途徑的主要調(diào)節(jié)機(jī)制之一，影響著癌癥的發(fā)展。據(jù)文獻(xiàn)顯示，在肺癌、膀胱癌、肝癌、鼻咽癌及腸癌患者中p14基因出現(xiàn)高甲基化。Xiaofang L等研究發(fā)現(xiàn)膽管癌中p14的甲基化率為24.0%，而正常組織中未發(fā)現(xiàn)甲基化，且甲基化程度與膽管癌的病理生物學(xué)行為及患者預(yù)后有關(guān)[2]。Lassacher A等研究發(fā)現(xiàn)Merkel細(xì)胞癌中p14的甲基化率為42.0%，未發(fā)現(xiàn)p14基因的突變，認(rèn)為p14的甲基化與皮膚Merkel細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)[3]。有關(guān)子宮內(nèi)膜癌的研究顯示，p14表達(dá)異常促進(jìn)了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展[4～5]。卵巢癌的發(fā)生與甲基化密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn) RASSF1A[6]、OPCML[7]、BRCA1[8]、WWOX[9]和ING4[10]在卵巢癌均出現(xiàn)高甲基化。但Teodoridis JM檢測了106例Ⅲ/Ⅳ期上皮性卵巢癌中24個基因的CpG島甲基化情況，其結(jié)果顯示OPCML、DCRI、RASSGIA、HICI、BRCAI和 MINT25 的甲基化率分別是 33.3%、30.7%、36.4%、17.3%、12.3%和 12.0%，其余的基因未檢測到甲基化（APAF-1，DAPK，F(xiàn)ANCF，F(xiàn)AS，p14，p21，p73，SOCS-3 和 SURVIVIN）或 是 低 甲 基 化 （OPCML，DCR1，RASSF1A，MINT25，HIC1 和 SFRP1）[11]。

本研究顯示，在正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤中未發(fā)現(xiàn)p14的高甲基化，上皮性卵巢癌中也未發(fā)現(xiàn)p14甲基化。采用熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測組織標(biāo)本中的p14mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示卵巢癌標(biāo)本中p14mRNA表達(dá)水平明顯高于卵巢良性腫瘤及正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。免疫組化顯示上皮性卵巢癌中p14蛋白表達(dá)明顯低于良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中的表達(dá)，三組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。分化程度隨組織異型性和p14蛋白缺失率增高而增高，但各組之間相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。Ⅲ期和Ⅳ期卵巢癌中p14蛋白表達(dá)缺失率較Ⅰ～Ⅱ期低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。提示p14基因異常表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系，但表達(dá)異常可能不是甲基化所致，p14基因甲基化失活在散發(fā)性卵巢癌中并不常見。與湯紹輝等研究的大腸癌中p14基因表達(dá)異常是p14基因甲基化所致不同[12]，這可能與缺少同類研究以及我們的研究在病例種類的構(gòu)成、標(biāo)本量等方面的局限有關(guān)，也可能與實(shí)驗(yàn)方法的不同有關(guān)；再者可能是甲基化發(fā)生率與卵巢上皮性腫瘤的組織學(xué)類型及卵巢癌分期密切相關(guān)，這樣可以解釋各研究者所報道的同一種基因在卵巢癌中的甲基化率不同，先前報道的卵巢癌中高甲基化多是在生殖細(xì)胞癌和透明細(xì)胞癌中[13]，而本研究中無卵巢生殖細(xì)胞癌病例，透明細(xì)胞癌僅1例。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論有待進(jìn)一步的研究和擴(kuò)大標(biāo)本量得以證實(shí)。

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