DNA甲基化改變與神經(jīng)管缺陷關(guān)系研究進展

黃蕓 林珊珊 任愛國

神經(jīng)管缺陷(neural tube defects,NTDs)的病因非常復雜，一般認為是遺傳、環(huán)境或二者的交互作用引起[1]。盡管國內(nèi)外研究機構(gòu)投入了大量的精力，運用了各種研究手段試圖尋找與NTDs發(fā)生相關(guān)的基因突變，但迄今為止，沒有任何一個基因突變能夠很好解釋人群NTDs發(fā)生風險，更無法用于個體風險預(yù)測和疾病篩查。

另一方面，表觀遺傳調(diào)控與NTDs的發(fā)生日趨受到重視[2]。表觀遺傳指在DNA序列不變的情況下，基因的表達發(fā)生了可遺傳的改變[3]。表觀遺傳調(diào)控可受物理、化學、生物等環(huán)境因素的影響，因此是研究基因與環(huán)境交互作用的窗口。DNA甲基化(DNA methylation)作為表觀遺傳調(diào)控的重要機制之一，與NTDs的發(fā)生有著復雜的聯(lián)系[4]。

一、特異基因甲基化與胚胎神經(jīng)管發(fā)育

DNA甲基化是指經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA-methyltransferases,DNMTs)的催化，將S腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine,SAM)提供的甲基添加在DNA分子上，此過程常發(fā)生在胞嘧啶-磷酸二酯鍵-尿嘧啶(CpG)雙核苷的胞嘧啶環(huán)C5上[5]。在哺乳動物中，主要有維持甲基化與建立甲基化作用的兩類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。前者已知有Dnmt1，其通過識別DNA上的半甲基化位點，使新合成的DNA鏈保持既定的甲基化水平。后者包括Dnmt3a與Dnmt3b，他們在未甲基化的基因上建立新的甲基化模式[6]。作為重要的表觀遺傳調(diào)控形式，DNA甲基化往往與基因表達負相關(guān)[7]。

在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中，DNA甲基化的動態(tài)調(diào)節(jié)對胚胎神經(jīng)管形成起至關(guān)重要的作用。Pax3基因在脊椎動物的神經(jīng)管、神經(jīng)嵴及體節(jié)表達，是參與神經(jīng)管形成的眾多基因中最為重要的基因之一，Pax3表達抑制可導致鼠胚NTDs的形成[8]。以小鼠為例，在胚胎發(fā)育早期，Pax3調(diào)控原件本呈高甲基化。在小鼠胚胎期8.5 d時，Pax3啟動子甲基化水平降低，Pax3開始在神經(jīng)上皮表達，稍后表達于體節(jié)，且伴隨著Pax3的表達，神經(jīng)管開始形成。此時，胚胎若受到體內(nèi)/外環(huán)境刺激，如氧化應(yīng)激，可導致Pax3啟動子持續(xù)高甲基化，最終因Pax3表達抑制誘導NTDs的形成[9]。

二、DNA甲基化改變與NTDs

為研究DNA甲基化與NTDs發(fā)生的關(guān)聯(lián)，許多研究在人群或動物模型中探索全基因組或某一特定位點甲基化水平。涉及的基因主要包括葉酸代謝相關(guān)基因與生長發(fā)育相關(guān)基因。

國內(nèi)一項病例對照研究發(fā)現(xiàn)[10]，NTDs患兒腦組織全基因組甲基化顯著低于對照組，DNA甲基化水平低于4.35%者，其患NTDs的風險是對照的5.736倍；依亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因型進行分組，發(fā)現(xiàn)基因型為T/T的NTDs病例表現(xiàn)出顯著的低甲基化。在荷蘭的病例對照研究中觀察到MTHFR低甲基化(-0.33%)與NTDs發(fā)生相關(guān)聯(lián)[11]。而加拿大的一項研究[12]則得出不同的結(jié)果，該研究收集了37例NTDs患兒與19例對照，分別檢測其MTHFR及全基因組DNA甲基化水平；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NTDs病例與對照間總體甲基化水平并無差異，與NTDs患者有廣泛DNA甲基化水平改變的假設(shè)不符，作者推測可能與加拿大實施面粉葉酸強化，極少出現(xiàn)個體葉酸缺乏的情況有關(guān)。

包括Hedgehog(Hh)通路及Wnt通路等在內(nèi)的胚胎發(fā)育相關(guān)基因位點亦受到廣泛關(guān)注。SHH基因過度激活可能導致NTDs的發(fā)生，PTCH1作為SHH的負向調(diào)節(jié)因子，對哺乳動物神經(jīng)管的發(fā)育起到重要作用。檢測187例NTDs患者及212例對照樣本PTCH1基因單核苷酸多態(tài)性與甲基化情況，發(fā)現(xiàn)該位點為c.3944C>T且呈高甲基化者患NTDs風險降低[13]。檢測甲氨蝶呤誘導的NTDs胎鼠神經(jīng)組織，發(fā)現(xiàn)其DNA總體甲基化水平顯著低于對照組；隨后對132個DNA甲基化異常位點進行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)Wnt通路中的Siah1b與Prkx位點甲基化程度降低，表達上調(diào)；這提示在葉酸代謝障礙的個體中，DNA低甲基化可能是NTDs發(fā)生的危險因素，Wnt通路中的Siah1b與Prkx基因可能是NTDs的候選基因[14]。HOX基因在時空水平上調(diào)節(jié)著神經(jīng)管的發(fā)育，針對HOX基因的甲基化檢測發(fā)現(xiàn)，HOXB7的低甲基化是NTDs的危險因素[15]。SOX基因編碼了調(diào)控胚胎發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，對細胞分化方向有重要影響[16]。提取脊髓脊膜膨出人群白細胞DNA，發(fā)現(xiàn)45個基因的75個CpG位點與NTD的發(fā)生有關(guān)；進一步檢測發(fā)現(xiàn)，僅SOX18基因出現(xiàn)顯著的整體低甲基化；在HEK細胞中誘導SOX18去甲基化，可使SOX18低甲基化并出現(xiàn)表達上調(diào)；將SOX18 mRNA注入斑馬魚中，可導致其NTDs的發(fā)生[17]。

以往神經(jīng)管缺陷研究中較少關(guān)注的一些因子，其甲基化狀態(tài)也被報道與NTDs有關(guān)。國內(nèi)一團隊通過檢測NTDs患兒及對照腦組織[18-19]，發(fā)現(xiàn)IGF2/Igf2調(diào)控元件DMR0高甲基化可增加NTDs患病風險 (OR=5.375)；隨后，該團隊檢測了NTDs及對照胎兒脊髓組織IGF2/Igf2轉(zhuǎn)錄水平及其DMRs甲基化水平，發(fā)現(xiàn)NTDs患兒IGF2/Igf2表達水平較對照上調(diào)6.41倍，但IGF2/Igf2 DMR0甲基化水平無顯著改變；在維甲酸誘導的NTDs胎鼠模型中，IGF2/Igf2表達較對照升高1.84倍，而IGF2/Igf2啟動子區(qū)僅出現(xiàn)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散化改變。在脊柱裂患兒的胎盤組織中，發(fā)現(xiàn)印跡基因GANS與三基序蛋白TRIM26的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)呈現(xiàn)低甲基化，GNAS與TRIM26蛋白水平也相應(yīng)升高，這提示胎盤組織某些基因的表觀遺傳狀態(tài)對胚胎NTDs的形成有一定影響[20]。長散布元件(LINE-1)是人體中唯一具有自主轉(zhuǎn)座能力的轉(zhuǎn)座子，即LINE-1可在染色體內(nèi)或不同染色體間改變相對位置，調(diào)控其他基因表達。有研究報道，胎兒神經(jīng)組中LINE-1低甲基化與NTDs發(fā)病有關(guān)聯(lián)[21]。為進一步研究人LINE-1(L1Hs)甲基化異常的組織特異性與神經(jīng)管缺陷的關(guān)聯(lián)，該團隊分別檢測了源于三個胚層的胎兒組織，胎盤與母體外周血L1Hs位點甲基化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母體外周血甲基化水平最高(64.95%)，胎盤最低(26.82%)；L1Hs低甲基化僅在患NTDs的胎兒腦部發(fā)現(xiàn)，尤其是女性胎兒；在女性胎兒中，還可觀察到L1Hs轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平升高；以上可能與L1Hs異常低甲基化導致的染色體親和性改變有關(guān)[22]。AKT2參與細胞增殖及血管生成因子在體外的分泌，使用基因芯片分析130例NTDs患兒及152例健康胎兒的胎盤組織DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)在病例組中，AKT2基因甲基化升高，同時基因的表達顯著降低，提示AKT2表觀遺傳改變與NTDs發(fā)病有關(guān)[23]。

三、一碳單位代謝因子、DNA甲基化與NTDs

一碳單位代謝異常引起的NTDs可能與甲基化異常有關(guān)[24-25]。圍受孕期葉酸攝入偏低與TFAP2A基因高甲基化及表達下調(diào)有關(guān)，提示DNA甲基化改變可能是圍受孕期葉酸缺乏導致胎兒NTDs發(fā)病的機制之一[26]。體內(nèi)葉酸濃度與DNA甲基化水平相關(guān)，葉酸缺乏可導致全基因組低甲基化，且該現(xiàn)象是可逆的，通過增補葉酸，降低的甲基化可重新升高[27]。目前普遍認為，以上現(xiàn)象源于葉酸的甲基供體角色。葉酸在一碳單位代謝過程中起到至關(guān)重要的作用，其在蛋氨酸循環(huán)中為同型半胱氨酸(Hcy)提供甲基，生成的蛋氨酸隨后與ATP作用生成甲基供體—SAM。SAM可在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下將甲基轉(zhuǎn)移至DNA分子上，完成DNA的甲基化。因此，在葉酸缺乏的情況下可造成DNA的低甲基化[28]。除了葉酸，其他參與一碳單位代謝的因子也可影響DNA的甲基化。HOX基因在補充葉酸或維生素B12后表達增強[29]。臍帶血LINE-1甲基化水平與孕婦血清Hcy水平呈負相關(guān)，但與孕婦血清葉酸水平及葉酸攝入量無顯著關(guān)聯(lián)。提示孕婦體內(nèi)葉酸代謝中間物水平可對其后代甲基化產(chǎn)生影響[30]。

由于葉酸是一碳單位供體，因此目前研究假設(shè)多為葉酸(暴露)水平與DNA甲基化呈正相關(guān)。但值得注意的是，與假設(shè)相反，部分人群研究表明DNA甲基化與葉酸水平并不呈正相關(guān)。有研究采用回顧性問卷調(diào)查法獲得母親葉酸攝入情況，并檢測343例健康新生兒血樣DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)葉酸攝入水平與基因組DNA甲基化呈負相關(guān)[26]。一項運用歐洲新生兒隊列分析母親血漿葉酸水平與胎兒臍帶血DNA甲基化關(guān)系的研究[31]，共發(fā)現(xiàn)了443個與母親血漿葉酸水平有關(guān)聯(lián)的GpC位點；但是，只有27個(6%)位點的甲基化水平隨血漿葉酸濃度的增加而升高，而絕大多數(shù)(94%)位點的甲基化水平反而隨血漿葉酸水平的增加而降低。這與一碳單位供給增加，甲基化水平升高的假設(shè)不一致。究其原因可能有三：(1)考慮到研究對象多為葉酸充足人群，認為可能存在葉酸閾值，即當體內(nèi)葉酸高于特定界值，DNA甲基化水平與葉酸間關(guān)系可能不表現(xiàn)為正相關(guān)；(2)由于甲基化過程尚未研究透徹，可能存在未知的混雜因素；(3)葉酸水平多采用食物頻率問卷法進行估計，可能存在測量誤差[32]。

四、環(huán)境污染物、DNA甲基化與NTDs

多環(huán)芳烴(PAHs)是環(huán)境中普遍存在的一類有機污染物，人群研究發(fā)現(xiàn)：(1)母親血液PAHs水平增加與胎兒NTDs風險增加有關(guān)[33]；(2)胎盤PAHs水平增加與胎兒NTDs風險增加有關(guān)[34]；(3)臍帶組織和臍帶血PAH-DNA加合物水平升高與胎兒NTDs風險增加有關(guān)[35]。最近研究報告顯示[36]，胎兒緊密聯(lián)接通路(tight conjunction pathway)基因CTNNA1和MYH2高甲基化與NTD發(fā)生有關(guān)，而苯并芘暴露與這兩個基因高甲基化存在相關(guān)性。提示，多環(huán)芳烴暴露增加胎兒NTDs風險之間可能是通過改變胎兒神經(jīng)管發(fā)育相關(guān)的緊密聯(lián)接通路基因DNA甲基化水平而起的作用。

砷可通過抑制甲基轉(zhuǎn)移酶3a與3b的表達與活性進而造成后代NTDs的發(fā)生，且誘發(fā)的NTDs不能通過葉酸拮抗[37]。砷可造成機體氧化應(yīng)激并導致全基因組低甲基化[38]。膽堿作為一類甲基供體，可拮抗砷導致的NTDs，提高總體DNA甲基化水平[39]。砷對DNA低甲基化的影響，可能與其導致的氧化應(yīng)激及S-腺苷甲硫氨酸/S-腺苷高半胱氨酸(SAM/SAH)比值降低有關(guān)[38]。

五、高糖、DNA甲基化與NTDs

孕期糖尿病作為NTDs的危險因素也可影響DNA的甲基化。將小鼠胚胎神經(jīng)干細胞置于高糖環(huán)境下培養(yǎng)，可觀察到部分發(fā)育調(diào)控基因甲基化與表達的改變[40]。提取孕期高血糖小鼠胚胎組織及其胚胎干細胞，發(fā)現(xiàn)孕期高糖導致的氧化應(yīng)激可使Dnmt3b活性增高，造成Pax3甲基化水平升高，進而導致Pax3表達抑制，誘發(fā)NTDs[9]。另一項研究表明，母親糖尿病可增加子代甲基轉(zhuǎn)移酶3a與3b的表達與活性，進而造成DNA整體甲基化水平及NTDs發(fā)生關(guān)鍵基因Grhl3,Pax3與Tulp3甲基化水平的升高；綠茶提取物EGCG可顯著降低高糖所致NTDs發(fā)病率，其機制可能為EGCG抑制甲基轉(zhuǎn)移酶3a與3b的表達與活性，進而拮抗DNA整體甲基化水平及Grhl3,Pax3與Tulp3甲基化水平的升高[41]。

六、存在的問題及展望

迄今為止，有關(guān)DNA甲基化與神經(jīng)管缺陷的研究結(jié)果缺乏重復。因此，甲基化改變與神經(jīng)管缺陷發(fā)生之間的真實關(guān)系需要后續(xù)更多的研究積累。更為重要的是，DNA甲基化具有組織和時間特異性。胎兒神經(jīng)管在孕5～6周之間閉合，而人體研究中所獲取神經(jīng)組織標本的時間大多在孕20周(胎齡18周)之后，所測的甲基化狀態(tài)未必能夠反映胎兒神經(jīng)管閉合時的真實狀態(tài)?；谔ケP組織、母親血液、胎兒非神經(jīng)組織的DNA甲基化研究，更是無法判斷與神經(jīng)管缺陷發(fā)生之間的關(guān)系。今后的人群研究中，如何獲取更接近于胎兒神經(jīng)管發(fā)育時期的標本，是研究的最大難點。另外，不同研究團隊之間協(xié)作，獲得不同人群均存在的特定基因甲基化改變，結(jié)果外推的可能性才會增大，才可能具備臨床應(yīng)用價值。

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