神經(jīng)炎癥和自噬在腦損傷中的作用

徐 雪, 張思然, 趙建波, 王艷芳, 張麗慧

(1. 杭州師范大學醫(yī)學院 藥理學教研室，醫(yī)學神經(jīng)生物學市級重點實驗室，浙江 杭州 310036；2. 浙江醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 杭州 310013)

小膠質細胞是腦內(nèi)重要的神經(jīng)免疫細胞，維持神經(jīng)元微環(huán)境的動態(tài)平衡，參與腦組織多種生理及病理過程。自噬指真核細胞通過溶酶體降解細胞內(nèi)受損、變性和衰老的蛋白質和細胞器，實現(xiàn)細胞穩(wěn)態(tài)以及自身物質代謝更新和循環(huán)再利用的重要調控機制。最近研究表明，自噬異常誘導小膠質激活及其神經(jīng)炎癥反應在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制中起關鍵作用[1-2]。本文主要介紹當前神經(jīng)炎癥與腦損傷的關系以及自噬參與腦損傷后炎癥反應的研究進展，在此基礎上，進一步討論自噬對炎癥反應的調節(jié)作用及機制。

1 神經(jīng)炎癥與腦損傷

神經(jīng)炎癥反應是腦缺血損傷以及帕金森病(Parkinson’s disease, PD)和阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD) 等中樞退行性疾病發(fā)生發(fā)展的關鍵因素。大鼠局灶性腦缺血以及體外缺糖缺氧誘導的缺血樣損傷研究表明，小膠質細胞激活及炎癥反應在缺血性腦損傷及神經(jīng)元死亡中起重要作用[3-4]。PD和AD研究顯示，腦內(nèi)小膠質細胞大量激活，腦組織和腦脊液中炎癥細胞因子(包括IL-1β、IL-6 和TNF-α)明顯增高并與疾病進展相關[5]。在PD小鼠模型，PD 神經(jīng)毒素l-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4- phenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridine, MPTP)誘導黑質紋狀體小膠質細胞炎癥激活與多巴胺(dopamine, DA)神經(jīng)元變性死亡一致[6]。在體外細胞培養(yǎng)，1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)激活的小膠質細胞釋放前炎癥細胞因子和氧化應激產(chǎn)物進一步促進神經(jīng)元損傷[7]。在AD研究的多種動物模型中，表達突變的淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)基因和早老素1(presenilin-1, PS1)基因的雙轉基因小鼠能較好地模擬人類AD患者腦內(nèi)病理改變，是AD研究的重要動物模型[8]。應用APP/PS1小鼠研究發(fā)現(xiàn)，皮層小膠質細胞激活及炎癥基因IL-1β、IL-6 和NLRP3表達水平與AD樣病理和認知障礙密切相關[8]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是經(jīng)典的小膠質細胞激活劑，黑質注射LPS刺激小膠質細胞激活及DA 神經(jīng)元變性死亡[9]。LPS 還誘導原代小膠質細胞和小鼠BV2小膠質細胞激活并釋放炎癥介質TNF-α、IL-1β，IL-6和活性氧(reactive oxygen species，ROS)；LPS 處理的BV2小膠質細胞條件培養(yǎng)液促進培養(yǎng)的PC12神經(jīng)元死亡[9-10]。因此，充分理解腦損傷發(fā)病過程中小膠質細胞介導的神經(jīng)炎癥的作用，可能為防止腦損傷的進行性發(fā)展提供潛在靶點。

2 自噬異常參與腦損傷后炎癥反應

自噬是繼細胞凋亡之后當前神經(jīng)科學研究的熱點和前沿領域之一。根據(jù)底物的種類、轉運方式以及調控機制的不同，細胞自噬主要分為三種類型：分子伴侶介導的自噬，微自噬和巨自噬。目前，對自噬的研究主要集中在巨自噬即通常所稱的自噬。細胞自噬發(fā)生過程主要包括吞噬泡(phagophore)的形成，自噬體(autophagosome)的形成，后者與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome)，并進一步通過溶酶體內(nèi)的酶降解底物[11]。自噬調節(jié)信號的改變有助于自噬活性的檢測。自噬相關蛋白Beclin1和LC3II表達增加提示自噬活化[12]，另一方面，自噬底物p62/SQSTM1(以下簡稱p62)蛋白水平升高通常被認為是自噬活性受抑制的標志[12]。正常生理狀態(tài)下細胞自噬維持在一定的基礎水平，自噬異常(自噬過度活化或不足)在中樞疾病的發(fā)病過程中具有重要作用。

已有研究報告，自噬參與腦缺血和中樞退行性疾病的神經(jīng)炎癥過程[13-14]。在小鼠永久性大腦中動脈結扎模型，腦組織缺血缺氧誘導小膠質細胞自噬和前炎癥細胞因子TNF-α, IL-1β和 IL-6增加。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤通過抑制自噬，預防缺血后的炎癥反應，減輕腦梗死、腦水腫和神經(jīng)功能障礙[13]。但是，相反的研究結果表明，自噬激活能減輕腦缺血后炎癥反應。在整體動物實驗，糖原合成激酶3β抑制劑SB216763通過誘導LC3II水平上調，減少永久性局灶性腦缺血大鼠皮層IL-1β，TNF-α和誘導型一氧化氮合酶水平。在培養(yǎng)的原代小膠質細胞，SB216763也增加小膠質細胞自噬活性，抑制炎癥反應；應用小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)技術誘導自噬標志蛋白Beclin1基因沉默，減弱SB216763在小膠質細胞的抗炎效應[14]。雖然仍不清楚自噬對小膠質細胞炎癥是正性或負性調節(jié)，上述結果提示自噬是調控腦缺血后小膠質細胞激活和炎癥效應的重要因素[1]。在SD大鼠PD實驗研究中，黑質注射PD神經(jīng)毒素MPP誘導α-突觸核蛋白聚集、小膠質細胞激活及小膠質CASP1/IL-1β表達，抗炎藥物黃芩苷增加LC3II水平，抑制MPP誘導的上述效應[15]。另一個小鼠的PD研究也表明，降血糖藥二甲雙胍通過誘導自噬活化(增加LC3Ⅱ和減少p62)，抑制小膠質細胞過度激活上調的NLRP3炎癥小體和前炎癥細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平，增加抗炎細胞因子IL-10水平，減輕MPTP加丙磺舒誘導的DA神經(jīng)元損傷和運動障礙[16]。在自噬相關基因(autophagy-related gene 7, Atg7)條件敲除小鼠和LC3或Atg 7基因沉默的小膠質細胞，AD神經(jīng)毒素Aβ誘導小膠質細胞激活、CASP1表達和IL-1β釋放增加；以Aβ處理LC3基因沉默小膠質細胞的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)神經(jīng)元，促進神經(jīng)元損傷；而藥物激活自噬可有效預防小膠質細胞炎癥和小膠質細胞介導的神經(jīng)毒性[17]。這些結果提示，自噬異常參與中樞疾病的神經(jīng)炎癥病理過程，調控小膠質細胞自噬水平對炎癥相關的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治具有重要意義。此外，細胞自噬是一個連續(xù)的高度動態(tài)變化的生物過程，自噬標志蛋白LC3Ⅱ增加可能是由于自噬活化早期自噬體形成增多，也可能是自噬后期自噬體與溶酶體融合障礙導致自噬體堆積的結果。自噬過程中任一環(huán)節(jié)的障礙將無法完成其生物學功能。因此，在自噬實驗中，應用自噬流檢測技術以準確評估細胞自噬活性變化，可進一步闡明自噬在腦損傷炎癥中的作用[12]。

3 自噬對炎癥反應的調節(jié)機制

近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬與LPS誘導的小膠質細胞炎癥激活存在復雜的關系。在LPS誘導的B6C3F1小鼠慢性炎癥模型，皮層和海馬炎癥細胞因子IL-1β增加，伴有自噬標志蛋白Beclin 1、p62和LC3改變[18]。在C57BL/6小鼠，LPS腹腔注射誘導腦內(nèi)p62持續(xù)堆積，LC3早期增加后期下降[19]。在體外研究，LPS處理的BV2細胞時間依賴性的增加聚集體樣LC3陽性斑點表達不被經(jīng)典的自噬抑制劑渥曼青霉素和Atg5 siRNA所抑制；在LPS和經(jīng)典的自噬誘導劑雷帕霉素共處理細胞，兩者獨立增加GFP-LC3標志點，Atg5 siRNA抑制雷帕霉素誘導的細胞自噬，但不抑制LPS的作用[20]。這些結果提示，LPS誘導BV2細胞非經(jīng)典型LC3陽性斑點[20]。LPS在BV2細胞誘導的聚集體樣LC3陽性斑點可能類似于巨噬細胞的聚集體樣誘導結構(aggresome-like induced structures, ALIS)[21]及樹狀突細胞ALIS[22]。在巨噬細胞的研究已經(jīng)證明，LPS通過激活Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)誘導p62依賴性ALIS選擇性自噬[21,23]。與巨噬細胞ALIS形成相似，LPS也增加BV2細胞p62表達[20-21]。最近的兩個研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導BV2細胞NLRP3炎癥小體激活和IL1-β增加，伴有自噬相關蛋白LC3Ⅱ、Beclin1增加和大量聚集的p62水平，提示自噬溶酶體降解功能障礙可能是炎癥細胞因子產(chǎn)生和釋放的原因。自噬抑制劑巴佛洛霉素A1和Atg5 siRNA不抑制LPS誘導的炎癥效應[24-25]。應用mRFP-GFP-LC3檢測細胞自噬流發(fā)現(xiàn)，LPS增加黃色自噬體和紅色自噬溶酶體數(shù)量，而α7-煙堿乙酰膽堿受體激動劑PNU282987促進自噬體向自噬溶酶體轉變，誘導高水平的自噬流。巴佛洛霉素A1或Atg5 siRNA阻斷自噬，抑制PNU282987在LPS刺激的BV2細胞的抗炎作用[25]。進一步研究顯示，mTOR依賴性自噬誘導劑雷帕霉素和非mTOR依賴性自噬誘導劑海藻糖誘導BV2細胞自噬活化，抑制LPS誘導BV2小膠質前炎癥細胞因子IL1-β , IL-6, TNFα和氧化應激產(chǎn)物水平，減少細胞死亡；相反，Atg5 siRNA和3-甲基腺嘌呤抑制自噬，促進LPS誘導的小膠質細胞激活和炎癥效應[20,26]。上述結果表明，LPS誘導小膠質細胞炎癥激活和非經(jīng)典型LC3陽性斑點，藥物和基因沉默方法抑制經(jīng)典型自噬不能抑制LPS誘導的小膠質細胞效應，自噬誘導劑誘導經(jīng)典型自噬激活可抑制LPS誘導的小膠質細胞炎癥激活和細胞死亡。

炎癥小體是由細胞內(nèi)多蛋白組成的復合物。目前已發(fā)現(xiàn)的炎癥小體主要有4種：NLRP1、NLRP2、NLRP3和AIM2。幾乎所有的炎性體之中都含有炎性蛋白(NOD-like receptor，NLR)，統(tǒng)稱NOD樣受體家族。在小膠質細胞/巨噬細胞中的炎癥小體主要是NLRP3，當細胞受到各種病理刺激時，NLRP3炎癥小體激活，通過產(chǎn)生活性的CASP1，進一步促進重要炎癥細胞因子IL-1β的成熟和釋放[27]。2011年，Tschopp研究組[28]在Nature期刊報道，THP1細胞和巨噬細胞中損傷線粒體釋放的ROS是調控NLRP3炎癥小體激活的關鍵信號。激活自噬減少損傷線粒體數(shù)量，可預防ROS促進的NLRP3炎癥小體激活，反之，自噬不足則加劇NLRP3炎癥小體激活。另一文獻表明相似的觀點，自噬抑制或不足導致TLR配體介導的IL-1α, IL-1β和IL-18分泌增加，這是TRIF和線粒體ROS/DNA依賴的，而激活自噬減少LPS誘導的pro-IL-1β和IL-1β水平，提示自噬作為IL-1家族的關鍵調節(jié)者，負性調節(jié)炎癥反應[29]。進一步對巨噬細胞自噬調節(jié)炎癥反應的作用機制研究表明，自噬對炎癥小體/IL-1β通路存在三個重要的作用環(huán)節(jié)：首先，自噬通過消化機能障礙的線粒體，預防線粒體釋放ROS對NLRP3炎癥小體的激活作用，提示自噬可能通過維持線粒體穩(wěn)態(tài)調節(jié)炎性反應。其次，自噬通過降解炎癥小體復合物，防止pro-IL-1β裂解成活性的細胞因子產(chǎn)物。最后，自噬通過包裹并降解pro-IL-1β蛋白，調控IL-1β的成熟和釋放[30-31]。與巨噬細胞相似，最近實驗結果表明自噬調節(jié)小膠質細胞NLRP3炎癥小體激活[1,17]。另一方面，NLRP3炎癥小體和IL-1家族能誘導自噬激活，提示存在炎癥和自噬的相互作用[27,29,32]。

4 結語

大量的實驗數(shù)據(jù)證明，神經(jīng)炎癥反應在腦缺血和中樞神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，自噬通過影響小膠質細胞炎癥激活參與腦損傷后炎癥病理過程。本文綜述了近年來神經(jīng)炎癥和自噬在腦損傷病理過程中的作用研究進展，為尋找神經(jīng)炎癥的重要治療靶點提供依據(jù)。隨著神經(jīng)科學實驗技術和方法的不斷發(fā)展和更新，小膠質細胞自噬和神經(jīng)炎癥與腦損傷的關系研究也正在不斷進展。因此，深入了解神經(jīng)炎癥和自噬在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病過程中的調控作用及機制，將有助于闡明炎癥相關的中樞疾病的病理生理特點，并進一步為相關中樞疾病的防治和藥物研發(fā)提供新策略。

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