液體活檢在結(jié)直腸癌領(lǐng)域的研究及應(yīng)用現(xiàn)狀

崔雪陽 綜述 邢承忠 審校

惡性腫瘤的發(fā)生主要是由于調(diào)控細胞增殖、分化的基因不斷變異累積造成。一直以來，組織標本是癌癥診斷的金標準，也是確定預(yù)后以及監(jiān)測治療的基石。通過組織樣本獲取的腫瘤分子表達譜不能反復(fù)獲得，只能提供腫瘤異質(zhì)性的“快照”，且分子譜常隨著疾病的進展而發(fā)生變化。在癌癥進展和治療過程中，由于內(nèi)源性及外源性的選擇壓力作用，腫瘤細胞的多個亞克隆種群相互競爭，促進優(yōu)勢子克隆體出現(xiàn)，而這些克隆體具有復(fù)制及轉(zhuǎn)移能力強、治療敏感性差等特點，最終導(dǎo)致腫瘤進展及耐藥發(fā)生[1-3]。

在腫瘤精準治療時代，有限的組織標本不能及時了解所有的腫瘤基因組變化，這可能錯失治療良機。而近年來引起極大關(guān)注的“液體活檢”(Liquid biopsy，LB)可能會彌補這些不足。本文將針對結(jié)直腸癌領(lǐng)域的液體活檢進行簡要概括。

1 液體活檢的生物學基礎(chǔ)

液體活檢技術(shù)主要通過無創(chuàng)手段提取血液、尿液、唾液、胸腔積液、腦脊液甚至糞便等，而這些體液都已經(jīng)被證實包含腫瘤來源的基因物質(zhì)?，F(xiàn)有研究證實[4-6]，液體活檢能夠測定癌癥患者的基因譜、監(jiān)測治療反應(yīng)、評估耐藥性的發(fā)生、量化微小殘留病灶。

1.1 循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cells，CTCs)

CTCs最早于1896年由澳大利亞的Thomas Ashworth在轉(zhuǎn)移性腫瘤患者血液中發(fā)現(xiàn)，但是直到近15年才引起廣泛關(guān)注。CTCs主要指腫瘤患者原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶釋放入外周血循環(huán)的腫瘤細胞，可以以單個細胞或者細胞簇形式存在[7]，通常CTCs濃度很低，在大多數(shù)腫瘤患者中，每10 mL外周血中能夠分離出1～10個細胞[8]。目前分離CTCs的技術(shù)多種多樣，例如，CTCs可以通過其大小及生物、物理性質(zhì)進行陰性富集，或者通過這些細胞表面常表達的生物標志物，如上皮細胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)來進行陽性富集[9]?，F(xiàn)有研究證實CTCs與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且CTCs的數(shù)量與治療效果及總生存期呈負相關(guān)[7]。即使在原發(fā)灶尚未出現(xiàn)癥狀之前，CTCs也極有可能在遠處停留，并處于休眠狀態(tài)，一段時間之后，休眠的細胞被重新激活，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移，但其機制目前尚不清楚[10]。

1.2 循環(huán)腫瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)

ctDNA是壞死或凋亡的腫瘤細胞釋放入外周血的DNA片段，主要來源于原發(fā)性腫瘤、CTCs、微轉(zhuǎn)移灶及轉(zhuǎn)移灶。ctDNA包含與其同源腫瘤細胞相同的基因缺陷，例如點突變、基因重組、擴增甚至基因拷貝數(shù)的變異等[11]。據(jù)統(tǒng)計，每天大約有3%的腫瘤DNA進入外周血循環(huán)中，而從腫瘤細胞中獲得的ctDNA的比例差別較大(1.4%～47.9%)，這在很大程度上取決于腫瘤的大小和分期[12]。并且，一旦進入循環(huán)系統(tǒng)，ctDNA通過肝臟、腎臟等快速清除，半衰期從16分鐘到數(shù)小時，雖然這帶來檢測上的挑戰(zhàn)，但是能夠反映腫瘤的實時變化狀態(tài)[11]。

1.3 外泌體

外泌體是一類直徑為40～100 nm的胞外盤狀囊泡，可由血細胞、上皮細胞、免疫細胞、血小板及平滑肌細胞等通過內(nèi)分泌及旁分泌的方式釋放到多種體液中，進而影響臨近細胞及遠處區(qū)域的生物學行為及功能。其內(nèi)容物包括蛋白質(zhì)、脂類、DNA、mRNA、miRNA及LncRNA等，通過調(diào)節(jié)受體細胞活性，在細胞通信及物質(zhì)運輸方面發(fā)揮重要作用[13]。并且，腫瘤來源的外泌體可以調(diào)節(jié)宿主微環(huán)境，刺激新生血管形成、增強腫瘤侵襲能力，最終導(dǎo)致疾病進展及遠處轉(zhuǎn)移[14]。

1.4 基于腫瘤血小板的RNA測序

腫瘤血小板(Tumor-educated blood platelets，TEPs)是腫瘤相關(guān)生物學信息的另一種來源，作為全身及局部反應(yīng)的中心分子，與腫瘤細胞相互作用，改變RNA表達譜，進而影響腫瘤的生長和擴散。Best等[15]研究者對不同類型的局部和轉(zhuǎn)移性腫瘤患者及健康個體進行TEPs的RNA測序，結(jié)果提示其區(qū)分腫瘤的準確率達到96%，并且可以區(qū)分6種不同類型腫瘤，其判斷原發(fā)腫瘤位置準確率達71%。因此，TEPs作為一種新興的液體活檢，可用于泛腫瘤分析、區(qū)分腫瘤類型以及腫瘤基因突變的診斷。

2 液體活檢與結(jié)直腸癌的研究熱點

2.1 在結(jié)直腸癌診斷中的作用

研究表明液體活檢技術(shù)因其非侵入性、敏感性高等優(yōu)勢，結(jié)合不同的生物學標志物，可用于結(jié)直腸癌的早期診斷。目前，臨床最普遍快捷的篩查結(jié)直腸癌的方式是便潛血試驗及糞便免疫化學試驗，雖然這兩種非侵入性方法都有助于降低結(jié)直腸癌的死亡率，但是特異性及敏感性較低[16]。Bettegowda等[17]通過數(shù)字PCR技術(shù)(Digital PCR，dPCR)發(fā)現(xiàn)100%的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能夠檢測到ctDNA，而非轉(zhuǎn)移性患者的檢測率達73%。霍普金斯癌癥中心通過新型的CancerSEEK方法，能對16個癌癥基因突變及10種循環(huán)中的蛋白標記濃度進行評估。對1 005名已被診斷罹患8種常見類型癌癥的I～III期患者以及812名健康對照者進行了研究；CancerSEEK檢測到癌癥的敏感性為69%～98%，特異性為99%。因此，CancerSEEK方法有利于癌癥的早期發(fā)現(xiàn)，降低死亡率[18]。

多項試驗證實外泌體包含的miRNA及蛋白組分的敏感性及特異性明顯高于目前臨床中應(yīng)用的腫瘤標志物CEA、CA19-9。最近，Ogata等[19]分析對比了結(jié)直腸癌患者與健康人群血清中16種外泌體來源的miRNA，其中l(wèi)et-7a、miR-21、miR-23a、miR-150、miR-223、miR-1229、miR-1246含量在患者血清中顯著升高，而手術(shù)切除后這些miRNA水平下調(diào)，并且miR-23a和miR-1246檢測早期結(jié)直腸癌敏感性分別為95%、90%。采用高度敏感的ExoScreen分析技術(shù)，檢測到結(jié)直腸癌細胞系外泌體表面存在膜蛋白CD147，并在患者血漿外泌體中得到相同結(jié)果，預(yù)示著CD147可能在未來成為早期診斷結(jié)直腸癌的指標[20]。

2.2 在結(jié)直腸癌預(yù)后中的作用

液體活檢不僅能夠早期診斷結(jié)直腸癌，而且可以評估疾病復(fù)發(fā)、預(yù)后及轉(zhuǎn)移。在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中，CTCs的存在可能是最早的亞臨床階段。一項對95例非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進行2年術(shù)后隨訪的研究顯示，CTCs基線數(shù)量≥5的患者在根治性術(shù)后1年內(nèi)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的比率是CTCs<5的8倍，這意味著CTCs可以作為無病進展生存期及總生存期的獨立預(yù)測因素[21]。另一項研究分析194名晚期肝轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后情況時發(fā)現(xiàn)，CTCs陽性與不可切除的肝轉(zhuǎn)移瘤密切相關(guān)，這也提示CTCs能夠影響肝轉(zhuǎn)移瘤的治療決策[22]。

Reinert等[23]開發(fā)了一項基于ctDNA的個性化檢測方法，并通過dPCR技術(shù)評估量化了6位復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌及5位非復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌患者血漿的ctDNA及體細胞結(jié)構(gòu)變異水平，研究結(jié)果證實ctDNA與傳統(tǒng)的隨訪方法相比，可以提前10個月檢測到腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)，其敏感性及特異性達100%。因此，對于根治性手術(shù)后的非轉(zhuǎn)移患者而言，ctDNA能夠在影像學及臨床證實復(fù)發(fā)之前，捕捉和監(jiān)測微小殘留病灶，并通過基因組的改變早期預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)。

血清中外泌體來源的miR-19a及miR-17-92基因簇的表達水平與結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，并且miR-19a的高水平表達也預(yù)示著疾病進展及預(yù)后不良[24]。而外泌體蛋白質(zhì)組學揭示了整合素α6β4、α6β1與肺轉(zhuǎn)移相關(guān)，αvβ5與肝轉(zhuǎn)移有關(guān)，這也表明不同的整合素表達模式可以預(yù)測器官特異性轉(zhuǎn)移[25]。另一項研究表明，外泌體來源的miR-200家族表達缺失，將導(dǎo)致腫瘤細胞更容易侵入血管及淋巴管，并且在5-氟尿嘧啶耐藥的細胞系中同樣觀察到外泌體分泌的miR-200家族表達水平下降。這提示了外泌體miR-200家族的缺失，將導(dǎo)致腫瘤侵襲性增加，更易耐藥[26]。

2.3 在結(jié)直腸癌治療中的作用

在臨床實踐中，Ⅱ期結(jié)直腸癌化療帶來的絕對生存獲益有限以及引起諸多不良反應(yīng)，導(dǎo)致Ⅱ期結(jié)直腸癌是否需要化療一直存在爭議。一項關(guān)于Ⅱ期結(jié)腸癌術(shù)后患者的前瞻性研究指出，在未接受輔助化療的178名患者中，14名在術(shù)后檢測到ctDNA，其中11人(占79%)在27個月的隨訪中復(fù)發(fā)，而其余164名ctDNA陰性患者中，僅有16例復(fù)發(fā)(HR=18，95%CI：7.9～40)。另一組接受化療的患者，化療結(jié)束后ctDNA的存在同樣降低了無復(fù)發(fā)生存率(HR=11，95%CI：1.8～68)。所以，在Ⅱ期結(jié)腸癌切除術(shù)后，ctDNA可以為微小殘留病灶提供直接證據(jù)，同時識別發(fā)風險高的患者，有助于制定輔助治療決策[27]。

在局部晚期直腸癌(Locally advanced rectal cancer，LARC)治療領(lǐng)域，CTCs計數(shù)及參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cells，Treg)可以評估預(yù)測新輔助治療的腫瘤客觀反應(yīng)情況。研究認為如果CTCs檢測陽性則應(yīng)建議患者接受更強的新輔助治療方案(如誘導(dǎo)化療)[28]。另外，直腸癌患者外周血中Treg含量明顯高于健康人群，而新輔助放療后存在不同程度的下降，并且與放療劑量相關(guān)。初步數(shù)據(jù)顯示，新輔助治療5天后，Treg含量高的LARC患者腫瘤分期較好(

轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者需要檢測RAS基因，來決定后續(xù)的治療方案，而以往的研究出現(xiàn)血液中與組織中檢測基因突變情況存在不一致性，即組織檢測為KRAS野生型而外周血中檢測為突變型。體內(nèi)和體外試驗的ctDNA分析表明，阻斷EGFR通路，KRAS和NRAS突變將快速出現(xiàn)，通常在影像學證實腫瘤復(fù)發(fā)之前，就能夠檢測到突變的發(fā)生。而觀察應(yīng)用西妥昔單抗或帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者ctDNA發(fā)現(xiàn)，阻斷EGFR通路，將導(dǎo)致KRAS突變克隆的產(chǎn)生，而停藥后克隆逐漸減少，一段時間后，腫瘤細胞能夠再次恢復(fù)藥物敏感性，這表明克隆進化持續(xù)存在，而ctDNA能夠動態(tài)監(jiān)測KRAS突變水平，為重新應(yīng)用抗EGFR類藥物提供依據(jù)[1]。另外，KRAS野生型及突變型的細胞系外泌體miRNA表達譜不同，miR-10b在野生型中選擇性上調(diào)，而miR-100在突變型中上調(diào)，這也提示外泌體miRNA作用于受體細胞，未來可能會成為預(yù)測KRAS突變的新模式，指導(dǎo)患者的治療方向[30]。

3 小結(jié)與展望

隨著精準醫(yī)療時代的來臨，液體活檢作為近年來新興起的分子診斷技術(shù)，在臨床診療工作中發(fā)揮著越來越重要的作用，為臨床實踐帶來機遇。它的優(yōu)勢在于可以動態(tài)監(jiān)測克隆進化、腫瘤負荷、指導(dǎo)靶向治療，在腫瘤個體化治療方面具有實用性。但是，目前液體活檢處于研究階段，仍然面臨很多挑戰(zhàn)，尚需要規(guī)范化技術(shù)及大規(guī)模前瞻性臨床試驗來證明。相信在不遠的未來，液體活檢可以更加精確全面的提供腫瘤基因組學信息，為患者帶來希望的曙光。