反相液相色譜對多肽的分離、純化與制備

閆鳳

摘要：隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，出現(xiàn)了各種多肽類藥物，多肽在臨床醫(yī)學中有巨大的應用價值。用反相高效液相色譜（RPLC）對兩種化學合成多肽-32肽和21肽進行了分離、純化和制備，能夠提高多肽的純度?；诖?，文章主要對多肽反相液相色譜法的分離、純化與制備進行了簡單的分析與研究。

關鍵詞：多肽；反相液相；分離、純化、制備

引言

多肽是氨基酸以肽鏈連接形成的化合物，其多肽在臨床醫(yī)學中有著較高的應用價值。在現(xiàn)代化生物技術的影響下，多肽化學合成技術水平也在不斷提升，但是，由于多肽化學合成的產(chǎn)物成分比較復雜，對其混合物進行分離提純優(yōu)化就顯得格外重要。只有對多肽化學產(chǎn)物進行分離提純，才能提高多肽產(chǎn)物的純度，保證多肽的藥用價值。

1反相液相色譜法概述

反相液相色譜法是液相色譜分離模式中使用最為廣泛的一種，該方法具有柱效高、分離能力強、保留機理清楚等優(yōu)點，對于生物大分子、蛋白質及酶的分離分析，反相液相色譜正受到越來越多的關注。在分配色譜中，組分在色譜柱上的保留程度，取決于它們在固定相和流動相之間的分配系數(shù)，組分在固定相上的保留時間越長，固定相與流動相之間的極性差值越大。而流動相為極性，固定相為非極性的液相色譜就是反相液相色譜。

2多肽反相液相色譜實驗分析

2.1實驗儀器與試劑選擇

第一，實驗儀器。選用型號為SCL-10AVP液相色譜儀，該色譜儀包括系統(tǒng)控制器、LC-10ATVP色譜泵、進樣閥、SPD-M10AVP二極管陣列檢測器、CLASS-VP5.33色譜工作站。色譜柱為200×4mmID的不銹鋼管，用勻漿法裝填德國進口Nucleosil4000-7C18反相色譜填料。KQ-250型超聲波清洗器、TLL-C臺式冷凍離心機、E-Pure純水器。

第二，試劑。試劑選擇色譜純乙腈、三氟乙酸（TFA）、32肽、21肽粗品。

2.2實驗方法

將合成多肽粗品用含乙腈水溶液溶解后，離心，保留上清液，棄去沉淀。取一定濃度的多肽樣品溶液進樣至已用流動相A液[水+0.1%TFA（VV%）]平衡過的RPLC色譜上，然后進行線性梯度洗脫直至達到要求的B液濃度[乙腈+0.1%TFA（VV%）]。流動相A、B液需超聲脫氣后使用。收集各色譜餾分進行檢測，再用100%B液洗脫10min，使殘余在柱上的物質完全沖洗下來，然后再用相應濃度的A液使柱平衡，以構成一個完整的色譜過程。流速1.0mL/min，32肽的檢測波長為215nm，21肽為280nm。

2.3實驗結果分析

2.3.1RPLC對合成多肽的分離

以乙腈作為流動相，用RPLC對合成的32肽和21肽的粗品進行分離。圖1（a）和（b）分別是32肽和21肽的RPLC色譜分離圖。

圖1（a）RPLC對合成32肽的色譜分離

（b）RPLC對合成21肽的色譜分離圖

從圖1對兩種多肽的分離結果可看出，二者的組成都比較復雜。由于沒有32肽和21肽的標準品進行對照，無法確認32肽和21肽的目標峰，因此必須收集主要的色譜餾分并對各色譜餾分進行定性分析，以便確定目標多肽色譜峰的位置。分別收集各色譜餾分，冷凍干燥處理后用飛行質譜對各色譜餾分的分子量進行測定（質譜圖未給出）。結果表明圖1（a）中的色譜峰3和圖1（b）中色譜峰2的餾分的分子量分別與合成32肽和21肽的分子量完全吻合，表明圖1中的色譜峰3、色譜峰2分別是32肽和21肽的目標峰。

2.3.2RPLC對多肽的制備

第一，梯度方式。從圖1看出32肽和21肽的組分都較復雜，需要選擇合適的色譜條件對其進行最優(yōu)化分離，這樣才能用最少的分離步驟和最短的時間得到合格的產(chǎn)品。由于32肽與雜質組分的性質非常相似，雖然選擇不同的梯度方式，用RPLC對32肽的分離效果還是得不到改善。而從圖1（b）可看出，只要選擇適當?shù)纳V條件，就可使21肽的目標峰（峰2）與雜質峰得到分離，因此對其梯度方式進行了選擇。

第二，進樣量。由于沒有制備型的反相色譜柱，所以我們用分析型的反相色譜柱通過多次收集樣品組分制備多肽。只要在保證柱子對樣品的基本分離效果的前提下，盡可能多的進樣，就可一次制備更多的樣品，從而縮短制備時間，故應對進樣量進行選擇。32肽和21肽的進樣量分別為1.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg和5.0mg。當進樣量大于5.0mg時，分離效果逐漸變差，因此，32肽和21肽制備時的進樣量為5.0mg。通過多次分離純化，對32肽和21肽的目標峰進行了大量的收集，然后將所收集的樣品進行凍干，除去水和有機溶劑。

2.3.3純度分析

用RPLC對32肽和21肽凍干樣品的純度進行分析檢測，分離后21肽的純度為98.6%，達到了產(chǎn)品純度95%的要求，而32肽的純度只有80%左右，達不到95%的純度要求，因此需要對其進行二次純化和制備。32肽經(jīng)RPLC分離純化后，其純度僅有80%左右，還含有較多雜質，因此需對其進行二次純化和制備。為了更好地分離純化32肽，必須對其分離條件再次進行優(yōu)化。

首先，對其分離梯度模式進行選擇，分別選用了5種線性梯度，線性梯度模式分別為：10%→60%B，30min線性；20%→60%B，30min線性；30%→60%B，30min線性；20%→40%B，30min線性；25%→35%B，30min線性。圖2給出了3種梯度模式下32肽的RPLC色譜分離圖。

圖2 不同線性梯度下32肽凍干樣品的RPLC色譜分離

從圖2可看出，用梯度e可使32肽與雜質進行有效分離，因此選用梯度e對32肽進行二次分離純化。優(yōu)化色譜分離條件后，通過對32肽的目標峰進行大量的收集，對32肽進行二次制備。當32肽凍干樣品的進樣量超過5.0mg時，樣品的分離度大大下降，因此進樣量選擇5.0mg。優(yōu)化色譜分離條件后，通過對32肽的目標峰進行大量的收集，對32肽進行二次制備。其色譜圖如下所示：

圖3二次制備的32肽的RPLC色譜分離

收集的樣品進行凍干處理，并用RPLC對32肽的純度進行色譜分析，經(jīng)計算其純度達到96.4%。經(jīng)計算其純度達到96.4%，通過36次的分離純化，共制備得到高純度的32肽100mg。

結束語

總而言之，通過對多肽的制備、分離、純化的實驗可以發(fā)現(xiàn)，在多肽制備過程中，其純度并不能完全達到標準要求，這就需要對其進行二次提純指標。對此，相關技術人員應注重多肽分離、純化技術的研究，為多肽的應用奠定堅實的基礎。

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