一例水貂肺炎克雷伯氏菌與綠膿桿菌混合感染的確診

陳超陽　和彥良　占才超

摘要：水貂肺炎是影響水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一種主要疾病，主要由于感染克雷伯氏和綠膿桿菌所致。本文以某一感染水貂肺炎的水貂養(yǎng)殖場為例，來闡述此病的實驗室鑒定和預(yù)防措施。

關(guān)鍵詞：水貂肺炎；克雷伯氏；綠膿桿菌；實驗室鑒定；預(yù)防措施

山東省膠南地區(qū)某水貂養(yǎng)殖場所養(yǎng)水貂零散發(fā)生一種以敗血癥、高死亡率為癥狀的傳染病，病貂的主要臨床癥狀表現(xiàn)為精神沉郁、食欲廢絕，1～2日內(nèi)突然死亡，個別死亡水貂出現(xiàn)口鼻出血，剖檢發(fā)現(xiàn)肺臟鮮紅。采集病料，經(jīng)實驗室分離鑒定，確診為肺炎克雷伯氏菌與綠膿桿菌混合感染?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1材料與方法

1.1樣品

患病死亡水貂肺臟，低溫運至實驗室，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑

TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、細菌革蘭氏染色試劑、綠膿桿菌生化鑒定試劑盒、克雷伯氏菌生化鑒定試劑盒、rTaq酶及D12000 Marker等。

1.3病源分離培養(yǎng)

取病料肺臟，無菌條件下用手術(shù)刀剪開新鮮切口，用接種環(huán)沾取切面后劃線接種TSA平板，至37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36h，觀察培養(yǎng)結(jié)果。從培養(yǎng)的平板上挑取單菌落接種TSB培養(yǎng)基，進行純化培養(yǎng)。

1.4涂片染色鏡檢

將純培養(yǎng)的細菌涂片，經(jīng)革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.5生化試驗

根據(jù)分離細菌的菌落形態(tài)和純培養(yǎng)結(jié)果，分別用綠膿桿菌生化鑒定試劑盒和克雷伯氏菌生化鑒定試劑盒進行生化試驗。

1.6PCR鑒定

取純培養(yǎng)菌液以12，000r/min離心5min，棄上清，用注射用水溶解菌泥，煮沸5min后作為DNA模板。采用本實驗室建立的綠膿桿菌和肺炎克雷伯氏菌的PCR方法進行鑒定。

1.7分離細菌的致病力試驗

將分離到的兩種細菌肉湯培養(yǎng)物分別腹腔注射小鼠，每種細菌培養(yǎng)物注射小鼠5只，0.2mL/只，同時設(shè)生理鹽水對照小鼠5只，攻毒后觀察7日，記錄小鼠死亡情況。

2結(jié)果

2.1病原分離培養(yǎng)結(jié)果

劃線TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后出現(xiàn)兩種不同形態(tài)的菌落（見圖1）。一種為扁平、邊緣不整齊的黃綠色中大型菌落；一種為光滑隆起、乳白色的小型菌落，接種針挑取時可拉出絲。挑取兩種單菌落分別接種TSB培養(yǎng)進行純培養(yǎng)，接種中大型菌落的培養(yǎng)物呈淡綠色混濁狀態(tài)，接種小型菌落的培養(yǎng)物呈淺褐色混濁狀態(tài)。

2.2染色鏡檢結(jié)果

中大型菌落的細菌為單個存在或成雙、呈短鏈排列的革蘭氏陰性桿菌；小型菌落的細菌為單個存在或成雙排列的革蘭氏陰性短桿菌。

2.3生化鑒定結(jié)果

中大型菌落的純培養(yǎng)物進行綠膿桿菌生化鑒定，結(jié)果符合綠膿桿菌生化特性（見表1）；小型菌落的純培養(yǎng)物進行克雷伯氏菌生化鑒定，結(jié)果符合肺炎克雷伯氏菌生化特性（見表2）。

2.4PCR鑒定結(jié)果

中大型菌落的細菌PCR結(jié)果見圖2，擴增出956bp的目的條帶，與綠膿桿菌預(yù)期結(jié)果相符；小型菌落的細菌PCR結(jié)果見圖3，擴增出428bp的目的條帶，與克雷伯氏菌預(yù)期結(jié)果相符。

2.5致病力試驗結(jié)果

攻毒7日后，腹腔注射生理鹽水的對照小鼠健活，注射綠膿桿菌菌液和肺炎克雷伯氏菌菌液的小鼠均于48h內(nèi)死亡，死亡小鼠剖檢均出現(xiàn)肺臟出血（見圖4）。

3小結(jié)與討論

1）根據(jù)臨床癥狀、剖檢變化及病貂肺臟細菌的分離鑒定，確定水貂發(fā)病是由綠膿桿菌和肺炎克雷伯氏菌混合感染引起的。

2）近些年，由綠膿桿菌和肺炎克雷伯氏菌單獨感染、或混合感染引起的水貂出血性肺炎越來越多，因兩種細菌均為條件性致病菌，所以加強水貂養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生，定期消毒，改善飼養(yǎng)條件和完善飼養(yǎng)管理，接種商品化疫苗，可以很大程度上預(yù)防由其引發(fā)的水貂肺炎。endprint