銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液對大鼠局灶性腦缺血的保護作用

羅燕平+張紅+胡晗緋+曹澤彧+張新莊+曹亮+王振中+蕭偉

[摘要] 探討銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷（MCAO）的保護作用，并探討其可能的作用機制。雄性SD大鼠140只，隨機分為假手術組、模型組、銀杏提取物注射液（金納多，1.0 mL·kg-1）、尼莫地平注射液（0.2 mg·kg-1）組、銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（5.2，2.6，1.3 mg·kg-1）組；所有動物手術前4 d尾靜脈注射給藥（模型組及假手術組給予生理鹽水）。除假手術組，其他動物通過右側大腦中動脈線栓塞法（MCAO）制作局灶性腦缺血再灌注模型。缺血3 h 后，所用動物再次尾靜脈注射給藥。大鼠缺血再灌注后進行神經(jīng)行為學評分并采用TTC染色法觀察腦組織梗死率；測定腦組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、乳酸（LA）含量及腦脊液中 Ca2+，谷氨酸（Glu），天冬氨酸（Asp）以及磷酸肌酸激酶（CK-BB）和乳酸脫氫酶（LDH）含量的變化。與假手術組相比，模型組大鼠腦梗死率顯著增加，神經(jīng)嚴重缺損；腦組織勻漿中MDA、LA含量升高，GSH、SOD含量降低；腦脊液中Ca2+濃度降低，Glu和Asp的含量及CK-BB、LDH含量顯著升高。與模型組相比，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液高、中劑量組能顯著減少腦梗死率，改善腦神經(jīng)功能缺損癥狀；提高 SOD、GSH活性，減少血清中MDA、LA含量；升高腦脊液中Ca2+濃度，減低神經(jīng)遞質Glu和Asp的含量及CK-BB、LDH的含量。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液能明顯改善模型動物的神經(jīng)功能缺損，其機制可能與修復血腦屏障，減少自由基，減少細胞外游離鈣內(nèi)流，降低腦脊液中興奮性氨基酸含量等有關，從而保護腦缺血。

[關鍵詞] 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液； 腦缺血再灌注； 超氧化物歧化酶； 神經(jīng)遞質； 鈣離子

[Abstract] To investigate the protective effects of ginkgo diterpene lactone meglumine injection （GDLMI） on cerebral focal ischemia reperfusion injury induced by middle cerebral artery occlusion （MCAO） in rats， and explore its possible mechanism. One hundred and forty male SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， ginkgo biloba extract injection （Ginaton， 1.0 mL·kg-1） group， nimodipine （0.4 mg·kg-1） group， and GDLMI （5.2， 2.6， 1.3 mg·kg-1） groups； All of rats received corresponding drugs by tail vein injection 4 days before operation （normal saline in model group and sham operation group）. Except the sham operation group， the cerebral ischemic stroke model was established by MCAO method in right brain of the other rats. After 3 h of ischemia， all the animals received intravenous administration again. The neurobehavioral scores of rats after ischemia-reperfusion were evaluated and the infarct rate of brain tissue was observed by TTC staining. The super oxide dismutase （SOD）， glutathione （GSH）， malondialdehyde （MDA） and lactic acid （LA） contents in brain tissue homogenate and the concentration of Ca2+， glutamate （Glu） and aspartate （Asp）， creatine phosphate kinase （CK-BB） and lactate dehydrogenase （LDH） content changes in cerebrospinal fluid were measured. As compared with the sham operation group， the cerebral infarction rate was increased significantly in the model group； the content of MDA and LA in the homogenate of brain tissue was increased， and the content of GSH and SOD was decreased； in cerebrospinal fluid， Ca2+ concentration was decreased， and the content of Glu and Asp， CK-BB and LDH increased significantly. As compared with the model group， the high and medium dose GDLMI groups can significantly reduce the cerebral infarction rate and improve the symptoms of neurological impairment； increase SOD and GSH activity， reduce MDA and LA content in serum； increase Ca2+ concentration in cerebrospinal fluid and decrease the content of neurotransmitter Glu and Asp as well as CK-BB and LDH. GDLMI could obviously improve neurologic impairment in model rats， and the mechanism may be related to recovering the blood brain barrier， scavenging free radicals， decreasing free Ca2+ inflow into the cells and the content of excitatory amino acid in cerebrospinal fluid to improve its protective effect on cerebral ischemia.endprint

[Key words] ginkgo diterpene lactone meglumine injection； cerebral ischemia reperfusion injury； super oxide dismutase； neurotransmitter； Ca2+

據(jù)統(tǒng)計，我國約有7 000萬腦卒中患者，其中缺血性腦卒中約占70%。缺血性腦卒中具有復發(fā)率高（17.7%），致殘率高（33.3%～44.6%），病死率高（11.4%～15.4%）的特點[1]。臨床上治療缺血性腦卒中的藥物主要為抗血小板藥物，如阿司匹林、氯吡格雷；該類藥物長期服用存在出血風險，并易產(chǎn)生抵抗作用；臨床聯(lián)合用藥發(fā)現(xiàn)，將抗血小板藥物與神經(jīng)保護藥物聯(lián)用，可顯著改善缺血性腦卒中患者的神經(jīng)功能缺損癥狀[2]。開發(fā)一種既能抗血小板又能改善神經(jīng)功能，且出血風險低的藥物具有較好的應用前景。

銀杏內(nèi)酯是銀杏葉中一類重要的成分，主要含有倍半萜內(nèi)酯和二萜內(nèi)酯[3]；已鑒定的二萜內(nèi)酯類化合物有銀杏二萜內(nèi)酯 A，B，C，J，K，L，M，N，P，Q 等。前期藥理研究報道，銀杏中二萜內(nèi)酯類化合物具有較好的抗血小板聚集、抗炎、保護心腦血管的活性[4-5]，可有效預防治療心腦血管疾病[6]。基于此，采取現(xiàn)代提取富集工藝從銀杏葉中制備出了以二萜內(nèi)酯為主要成分的原料藥，隨后開展了系列的藥理作用研究，以探討銀杏二萜內(nèi)酯治療局灶性腦缺血的作用。

1 材料

1.1 藥品與試劑

銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號000409）；銀杏葉提取物注射液（金納多注射液，德國威瑪舒培博士藥廠，批號6580199，7.5 mg銀杏提取物 5 mL/支）；尼莫地平注射液（德國拜爾出品，批號 CATEZ1），水合氯醛 （國藥集團化學試劑有限公司，批號20000609），氯化三苯基四氮唑（TTC，Sigma 公司，批號 122016），丙二醛測定試劑盒（MDA），批號20000715；超氧化物歧化酶測定試劑盒（SOD），批號20000705；谷胱甘肽測定試劑盒（GSH），批號20000721；乳酸測定試劑盒（LA），批號20000705；考馬斯亮藍劑盒，批號20000825；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒，批號20000515，磷酸肌酸激酶 （CK-BB） 試劑盒，批號20000524，鈣（Ca2+）試劑盒，批號20000625；均由南京建成生物工程研究所提供。其他試劑均為市售分析純。

1.2 動物

SD大鼠，雄性，SPF級，6月齡，體質量300～400 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，合格證號 SCXK（滬）2008-0016。動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，12/12 h 明暗交替，溫度為22～25 ℃，相對濕度50%～60%，動物自由進食飲水，適應5 d后開始試驗。

1.3 儀器

TSQ-280 型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海精宏實驗設備有限公司），DHG-9053A 型電熱恒溫干燥箱（上海醫(yī)用恒溫設備廠），AU600 型全自動生化分析儀（日本 Olympus公司），Agilent1100 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），5804R型冷凍離心機（Eppendorf公司），BS224S 型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）

2 方法

2.1 分組與給藥

大鼠隨機分為7組：假手術組、模型組、金納多注射液（1.0 mL·kg-1）、尼莫地平注射液（0.2 mg·kg-1）組、銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（5.2，2.6，1.3 mg·kg-1）組，每組20只；造模前4 d，每天尾靜脈注射給藥1次，最后一次給藥30 min后進行腦缺血造模，再灌注后注射相同的藥物；假手術組和模型組于相同時段注射等體積生理鹽水。

2.2 模型制備

參考Longa等的方法[7]，采用頸內(nèi)動脈線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型。大鼠用10%水合三氯乙醛（300 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，仰臥恒溫手術臺上頸部正中切口，暴露右側頸總動脈，向外牽引二腹肌及胸鎖乳突肌，由頸總動脈分叉處向頭端依次游離，結扎并剪斷頸外動脈的分支：枕骨下動脈和甲狀腺上動脈，在頸外動脈遠端結扎，切斷頸外動脈使其主干游離備用，然后分離頸內(nèi)動脈，用絲線在頸外動脈根部打一松扣，夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈。將尼龍線（長4 cm，直徑0.26 mm）經(jīng)頸外動脈主干切口，緩慢向頸內(nèi)動脈入顱方向推進，以頸總動脈分叉處為標記，推進20 mm左右時感到阻力，即達到了較細的大腦前動脈內(nèi)，阻斷了MCA的所有血供來源，扎緊頸外動脈根部松扣。1 h后，拔出尼龍線，扎緊動脈殘端?？p合皮膚，完成MCAO導致局灶性腦缺血-再灌注模型。假手術組大鼠麻醉后，僅暴露頸內(nèi)外動脈分叉，不閉塞MCA。

2.3 檢測指標

2.3.1 行為學評分 術后24 h按Bederson的方法對動物的行為缺陷進行分級評分，提尾懸空離地面約 35 cm，觀察兩前肢狀況；將大鼠置于水平地面，推動其雙肩，觀察兩側抵抗力的差異。標準如下：0級，未觀察到神經(jīng)癥狀；1級，提尾懸空時，動物的手術對側前肢表現(xiàn)為腕肘屈曲，肩內(nèi)旋，肘外展，緊貼胸壁；2級，將動物置于光滑平面上，推手術側肩向對側移動時，阻力降低；3級，動物自由行走時向手術對側環(huán)轉或轉圈；4級，軟癱，肢體無自發(fā)活動[8]。

2.3.2 TTC染色法觀察大鼠腦梗死率 MCAO 24 h后，斷頭處死大鼠，取出全腦，左右腦分別切開，稱重。在右腦視交叉及其前后各2 mm處，做冠狀切，腦切片于1%TTC溶液中避光37 ℃孵育25 min，用眼科鑷分離蒼白區(qū)（梗死區(qū)）和非蒼白區(qū)（正常區(qū)），計算梗死百分比[9]。

梗死率=蒼白區(qū)質量/（蒼白區(qū)質量+非蒼白區(qū)質量）×100%endprint

將染色后的腦組織置于110 ℃烘箱烘干，對照大腦濕重求出腦含水量如下。

腦組織含水量=（1-腦組織干重/腦組織濕重）×100%

2.3.3 腦組織勻漿中SOD，GSH，MDA，LA量的檢測 缺血再灌注24 h后，大鼠斷頭處死，取腦，去除小腦。將大腦用生理鹽水制成10%勻漿，按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書，測定大腦組織中的超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽（GSH），丙二醛（MDA）和乳酸（LA）含量。腦勻漿蛋白含量按考馬斯亮藍法測定[10]。

2.3.4 腦脊液中氨基酸類神經(jīng)遞質Glu和Asp 及Ca2+，CK-BB，LDH 測定 再灌注 24 h 后，大鼠以10%水合氯醛麻醉，剪開背面頸部皮膚，鈍性分離頸部肌肉，暴露枕骨大孔。將大鼠頭向腹面彎曲，用 1 mL 一次性注射器輕輕刺穿腦膜，抽取腦脊液約 100 μL。所得腦脊液以1 000 r·min-1離心3 min，取上清液，超濾杯過濾離心（8 000 r·min-1離心5 min）后待用。取過濾后的腦脊液樣品 10 μL，行柱前衍生化反應并HPLC分析Glu和Asp。Ca2+，CK-BB，LDH 的測定嚴格按照各試劑盒操作要求進行測定[11]。

2.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)以±s表示，SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，多組間均數(shù)采用One-way ANOVA法檢測顯著性，P<0.05差異顯著。

3 結果

3.1 MCAO 大鼠的神經(jīng)行為學評分及腦血管梗死率和腦含水量的影響

缺血再灌注后，與假手術組相比，模型組神經(jīng)行為評分、腦梗死率及腦含水量均有顯著性差異（P<0.01）；與模型組相比，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液高、中劑量及金納多注射液、尼莫地平注射液均能降低神經(jīng)行為評分、腦梗死范圍以及腦含水量 （P<0.05），見表1。

3.2 對 MCAO大鼠血清生化指標的影響

與假手術組相比，模型組大鼠血清中的MDA，LA含量顯著增加，SOD，GSH含量顯著減少（P<0.01）；與模型組相比，銀杏二萜內(nèi)酯注射液高、中劑量組及金納多注射液組、尼莫地平注射液組大鼠血清中的MDA，LA含量顯著減少，SOD，GSH含量顯著增加（P<0.01）；低劑量組效果未見顯著性差異，見表2。

3.3 對MCAO大鼠腦脊液指標的影響

與假手術組相比，模型組大鼠腦脊液中Ca2+含量顯著低于假手術組（P<0.01）；LDH含量及

CK-BB，Glu，Asp活性均顯著高于假手術組（P<0.01）。與模型組相比，銀杏二萜內(nèi)酯注射液高、中、低3個劑量組，金納多注射液，尼莫地平注射液均可顯著提高大鼠腦脊液Ca2+的含量（P<0.05），顯著降低神經(jīng)遞質Glu和Asp 含量及CK-BB，LDH的含量（P<0.05），見表3。

4 討論

腦缺血再灌注造成的損傷病理及生理過程極為復雜，腦中血流中斷導致局部腦組織處于缺血缺氧狀態(tài)，細胞能量代謝發(fā)生紊亂[12]。缺血再灌注后使腦組織細胞發(fā)生損傷級聯(lián)放大效應，包括能量代謝障礙、生成自由基[13]、激活凋亡基因、炎癥反應、細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等，最終誘發(fā)細胞凋亡[14-15]。本研究結果顯示銀杏二萜內(nèi)酯注射液可使局灶性腦缺血大鼠再灌注損傷的腦組織內(nèi)的MDA，LA等含量降低，表明組織缺血缺氧和過氧化程度受到明顯抑制；同時SOD和GSH含量增加，反映了藥物對機體抗氧化能力和清除自由基的能力有提高。

腦缺血再灌注過程中，局部腦組織可通過神經(jīng)元突觸或者胞體與腦脊液發(fā)生信息交流，因此腦脊液中相關成分變化能夠在一定程度上反映腦組織的損傷情況。Glu、Asp、甘氨酸等氨基酸為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中傳遞興奮性的主要神經(jīng)遞質，過度釋放興奮性氨基酸并激活相應受體將導致興奮性神經(jīng)毒性，可在較大程度上影響腦缺血再灌注損傷的預后[16]。本研究結果顯示大鼠缺血再灌注24 h后，腦脊液中Glu，Asp 含量顯著增高；而銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液及其主要成分作用之后，能有效降低腦脊液中興奮性氨基酸的含量，表明銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液能修復腦內(nèi)的因缺血引起的氨基酸動態(tài)平衡失調。

在正常情況下，機體神經(jīng)元通過控制細胞膜對Ca2+通透性來維持鈣離子的內(nèi)外平衡。腦缺血再灌注過程中細胞膜通透性發(fā)生改變，使細胞內(nèi)Ca2+高于正常水平，導致腦組織受傷[17-18]。細胞內(nèi)鈣濃度的異常升高可誘發(fā)Ca2+依賴性的谷氨酸持續(xù)釋放，Glu的過度釋放可引發(fā)神經(jīng)細胞凋亡的級聯(lián)反應[19]。本研究檢測了缺血再灌注動物模型給藥前后腦脊液中 Ca2+濃度的變化，發(fā)現(xiàn)模型組腦脊液中Ca2+濃度顯著低于假手術組，可能與Ca2+向細胞內(nèi)流有關。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液能在一定程度上升高腦脊液中Ca2+含量，表明其可能通過改善離子轉運，從而減少缺血再灌注引起的Ca 2+濃度失衡。

CK一種是由B和M型2個亞單位組成的二聚體同工酶。腦組織中主要是CK-BB，正常情況下，CK-BB 在血液及腦脊液中含量極低。腦組織發(fā)生損傷時，腦細胞膜通透性增加，CK-BB 被釋放入細胞間隙，并通過受損的血腦屏障進入血液，故CK-BB在血及腦脊液中的含量變化可反映腦細胞受損的嚴重程度[20]。正常情況下LDH 只能在腦細胞的胞漿中檢測到，當腦破損時可從腦細胞溢出，使腦脊液中的LDH酶濃度升高。因此當腦脊液中LDH，CK-BB酶濃度發(fā)生變化表明腦組織受到了損傷，且與濃度呈正相關。本實驗結果表明銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液可降低大鼠腦脊液中磷酸肌酸激酶和乳酸脫氫酶的含量。

本研究表明銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液可顯著降低局灶性腦缺血再灌注后大鼠腦組織的梗死范圍和含水量，改善其神經(jīng)行為。腦組織勻漿生化指標檢測發(fā)現(xiàn)該藥能顯著降低腦組織中MDA，LA含量，升高GSH，SOD含量。提高模型大鼠腦脊液中 Ca2+，并降低CK-BB，LDH的含量及神經(jīng)遞質 Glu 和 Asp含量。表明該藥對大鼠實驗性局灶性腦缺血有顯著的保護作用。作用機制可能與其修復血腦屏障、改善離子轉運，減少急性腦缺血后細胞內(nèi)鈣超載和興奮性氨基酸的釋放，從而阻斷一系列腦損傷瀑布效應，延遲神經(jīng)元死亡，改善模型動物的神經(jīng)功能缺損，發(fā)揮對腦缺血的保護作用。endprint

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[責任編輯 孔晶晶]endprint