甲型流感病毒M2蛋白研究進展

劉亞輝　郭潮潭

[摘要] M2蛋白是流感病毒包膜上的具有離子通道活性的膜蛋白，在流感病毒的整個生活周期中具有重要作用。M2蛋白N端高度保守，是研究通用疫苗的重要靶點，其跨膜區(qū)在病毒核糖核蛋白（RNP）復(fù)合體入核過程中起重要作用，同時又是藥物作用的靶點，但耐藥性突變體的出現(xiàn)使得新藥的研究變得更加緊迫，M2蛋白還參與病毒的出芽過程，對病毒顆粒的形成非常重要，M2蛋白還能通過復(fù)雜的機制操縱細胞自噬和凋亡，從而控制病毒的復(fù)制。本文就M2蛋白在疫苗研究、質(zhì)子傳導(dǎo)、藥物研究、裝配與出芽、自噬與凋亡等幾個方面的最新研究進展作一綜述。

[關(guān)鍵詞] 流感病毒；M2蛋白；離子通道；出芽

[中圖分類號] R511.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（a）-0037-04

[Abstract] M2 protein is a kind of membrane protein with ion channel activity in the envelop of influenza virus， which plays an important role in the life cycle of influenza virus. The N-terminal of the M2 protein is highly conserved， which is an important target for researching the universal vaccine. The transmembrane domain of M2 protein plays an important role in the progress of virus ribonucleoprotein complex entering into the nucleus， it is also the target for drug binding， but the appearance of drug-resistant mutants make the research of new drugs much more urgent. M2 protein also participates in the progress of virus budding， which is of great importance for the formation of virions. M2 protein can control the autophagy and apoptosis for the purpose of controlling the replication of virus through sophisticated mechanisms. This paper makes a review of M2 protein in the following aspects： vaccine research， proton conduction， drug research， assembly and budding， autophagy and apoptosis.

[Key words] Influenza virus； M2 protein； Ion channel； Budding

流感病毒屬于正黏病毒科，是一種內(nèi)含8條節(jié)段狀RNA的負義RNA病毒，能夠感染禽類、人類和其他多種哺乳動物。流感病毒RNA編碼多種蛋白，其中病毒包膜上有HA、NA和M2三種膜蛋白，M2蛋白在流感病毒感染宿主細胞中具有重要作用。M2蛋白由流感病毒RNA第7片段經(jīng)剪接編碼表達，是流感病毒包膜上的一種跨膜蛋白，其通過二硫鍵將相鄰的二聚體連接而形成左手螺旋的四聚體。M2蛋白由97個氨基酸組成，包括24個氨基酸殘基形成的N末端胞外域（extracellular domain of M2，M2e），19個氨基酸殘基形成的跨膜域，54個氨基酸殘基形成的C末端胞質(zhì)尾，胞質(zhì)尾的前17個氨基酸殘基形成了一個兩性螺旋[1]。近年來針對M2蛋白的研究取得了長足的進展，促進了流感病毒的防治，本文針對這些研究進展作如下綜述：

1 M2蛋白與疫苗研究

M2非常保守，而M2e高度保守。自1933年以來從人體分離的流感病毒，M2e序列幾乎沒有發(fā)生改變，與禽流感病毒的M2e序列也僅僅有幾個氨基酸不同[2]，這為“通用疫苗”的研究提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。但單獨的M2e免疫原性很弱，在小鼠中并不能夠誘導(dǎo)足夠的免疫反應(yīng)，與鋁或弗林佐劑結(jié)合可增加其免疫原性[3]。因此，增加M2e的免疫原性，成為當前“通用疫苗”研究的主要方向。有人將異源的M2e構(gòu)成重復(fù)序列M2e5x，用酵母表達系統(tǒng)表達，然后用佐劑AS04聯(lián)合M2e5x免疫小鼠，誘導(dǎo)的抗體能夠與異源M2蛋白反應(yīng)，產(chǎn)生廣泛的交叉免疫[4]。將人與禽M2e與鼠傷寒沙門菌的鞭毛蛋白融合，用本氏煙草植物表達后獲得了占總蛋白30%的融合蛋白，構(gòu)建的融合蛋白免疫小鼠后誘導(dǎo)了特異性的免疫，高效地保護了小鼠[2]。將M2e與乙肝核心抗原結(jié)合形成的類病毒顆粒進行動物實驗也提供了很高的保護率[5]。這些結(jié)果均說明了M2e與佐劑及免疫原結(jié)合增加了M2e的免疫原性，除此之外，不同的免疫途徑也會對疫苗的效果產(chǎn)生影響，鼻腔免疫的效果優(yōu)于皮下注射[6]，而與其他的疫苗聯(lián)合使用，也能夠明顯增強免疫效果[7]。因此，從增強M2e免疫效果這點來看，合適的佐劑，增加M2e序列數(shù)量及其多樣性，構(gòu)成融合蛋白及類病毒顆粒，合適的免疫途徑，疫苗的聯(lián)合使用等都是可行的方法。

以M2e為基礎(chǔ)的疫苗并不是通過抗體的中和作用來發(fā)揮其交叉保護作用的，Lee等[8]提出保護機制是抗體依賴的細胞毒性作用和補體依賴的細胞毒性作用。但在2011年，研究者卻發(fā)現(xiàn)了一種具有中和活性的M2抗體M2-7A[9]。endprint

2 M2蛋白與質(zhì)子傳導(dǎo)

M2跨膜區(qū)形成一個傾斜的四聚體螺旋，該區(qū)域具有離子通道活性，起到了傳導(dǎo)質(zhì)子的作用，M2蛋白的質(zhì)子傳導(dǎo)作用能使病毒內(nèi)部酸化，促進病毒RNP入核進行病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[10]。M2跨膜區(qū)是一個充滿水的孔道，跨膜區(qū)的Val27、Ala30、Ser31和Gly34在孔中成線性排列，Gly34、His37、Trp41和Asp44之間形成了三層水分子簇，對于質(zhì)子的連續(xù)傳導(dǎo)非常重要[11]；質(zhì)子傳導(dǎo)機制的核心是M2蛋白His37咪唑環(huán)的一半和M2蛋白螺旋束內(nèi)部水之間的質(zhì)子交換，Val27和Trp41在孔的兩端形成了兩個門[12]，Asp44可能將Trp41門穩(wěn)定為關(guān)閉構(gòu)像而起到穩(wěn)定四聚體的作用，直到一定數(shù)量的質(zhì)子在His37四聚體上積累[11]。

His37-Trp41四聚體是酸化和質(zhì)子傳導(dǎo)的中心，其中的His37起到了質(zhì)子傳導(dǎo)的作用，通道內(nèi)的4個His37殘基形成了一對咪唑-咪唑二聚體，通道N端的水合氫離子將一個質(zhì)子傳遞到咪唑-咪唑二聚體，當?shù)?個質(zhì)子結(jié)合到咪唑-咪唑二聚體上后，2個咪唑環(huán)旋轉(zhuǎn)（大約55°）分開，之后Trp41門打開，質(zhì)子釋放，進入病毒內(nèi)部，釋放質(zhì)子的咪唑-咪唑二聚體隨后重組，為下一個循環(huán)的質(zhì)子傳導(dǎo)做準備[13]。在整個質(zhì)子傳導(dǎo)的過程中，通道的構(gòu)像并不是不變的，而是隨著His37質(zhì)子化程度的改變而改變，通過在高pH和低pH環(huán)境下比較跨膜區(qū)域的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，其pH依賴性的構(gòu)像改變可能通過交替地改變通道N端和C端開口的大小而促進了質(zhì)子傳導(dǎo)[14]。Acharya等[12]提出通道在不同的pH下存在三種不同的構(gòu)像：不帶電形式（pH 7.5～8），中間形式（pH 6.5）以及低pH形式（pH 5）。在不帶電形式下，Val27門是打開的，質(zhì)子能夠從外部通過Val27門擴散進孔隙，使His37質(zhì)子化，相對而言，Trp41門疏水性開口很小，His37殘基并未暴露給病毒內(nèi)部環(huán)境，不能釋放質(zhì)子，隨著His37質(zhì)子化程度的增加，通道N端傾斜角度開始增加（相對于孔隙軸）：從不帶電形式的16°增加到中間形式的31°，最后增加到低pH下的38°。這種運動逐步地壓縮Val27門，最后使其在低pH下關(guān)閉了，相反，Trp41門極性開口逐漸變大，開始將質(zhì)子化的His37暴露給病毒內(nèi)部，當達到最高電荷狀態(tài)時，Trp41門打開了3～4 ？魡，使得質(zhì)子釋放進病毒內(nèi)部。當一個或幾個質(zhì)子從His37分離后，M2的整體構(gòu)像將會恢復(fù)成類似于中間形式的構(gòu)像。

3 M2蛋白與藥物研究

目前有兩種藥物能夠抑制M2離子通道活性：金剛胺和金剛乙胺。越來越多的證據(jù)表明，藥物結(jié)合在通道內(nèi)部孔的N端，藥理學(xué)結(jié)合位點為Ser31[15-16]。但Schnell等[17]發(fā)現(xiàn)金剛乙胺可以結(jié)合到通道C末端面向脂質(zhì)的外表面，隨后的研究也證實了這一現(xiàn)象，金剛乙胺結(jié)合在Asp44周圍，與Asp44形成一個氫鍵[18]。藥物對通道孔內(nèi)和通道外表面這兩個結(jié)合位點的親和性并不一樣，通道孔內(nèi)的藥物結(jié)合位點為高親和性位點，外表面的藥物結(jié)合位點為低親和性位點[18]。

目前認為藥物抑制的機制有兩種：對于通道孔內(nèi)部（Ser31周圍）的結(jié)合位點，藥物主要直接阻塞了質(zhì)子轉(zhuǎn)運；而對于外表面（Asp44周圍）的結(jié)合位點，藥物則通過變構(gòu)抑制效應(yīng)抑制質(zhì)子傳導(dǎo)[16，18]。高pH下，Val27門是打開狀態(tài)，金剛胺進入孔，在Val27門處形成空間障礙，阻止His37的質(zhì)子化而嚴重限制質(zhì)子轉(zhuǎn)運進入病毒內(nèi)部[19]；而在低pH（5.5）下，金剛胺的結(jié)合誘導(dǎo)了四聚體的穩(wěn)定化和通道C末端Trp41門的關(guān)閉，因而使得M2通道失活[20]。亞基內(nèi)氫鍵和鹽橋連接了Trp41、Asp44和Arg45的側(cè)鏈，穩(wěn)定了Trp41門，藥物與Asp44結(jié)合，通過將Trp41門穩(wěn)定為其關(guān)閉構(gòu)像，而抑制通道的變構(gòu)效應(yīng)，使得通道無法打開[16]。由此可見，無論是阻塞機制還是變構(gòu)抑制機制，最終都阻止了質(zhì)子的內(nèi)流，使得通道構(gòu)像不再發(fā)生變化，處于一個穩(wěn)定狀態(tài)。

隨著藥物的應(yīng)用，出現(xiàn)了以V27A、L26F和S31N為主的抗藥性突變，S31N的突變占了其中的絕大部分[21]。在S31N突變M2中，金剛胺進入通道的深處，水分子環(huán)繞在藥物周圍，能夠輕松地傳導(dǎo)質(zhì)子，因此藥物結(jié)合并沒有抑制質(zhì)子的轉(zhuǎn)運[22]。近年來有關(guān)針對抗性突變體的研究取得了不錯的進展，研究者人員發(fā)現(xiàn)了一些抑制劑能抑制抗藥性S31N突變體[23]，而抑制L26F和V27A抗藥性突變體的抑制劑也已經(jīng)被合成出來[24]。

4 M2蛋白與病毒裝配及出芽

流感病毒完成其轉(zhuǎn)錄復(fù)制后，開始病毒的出芽，出芽位點位于感染細胞頂端質(zhì)膜的脂筏區(qū)域。流感病毒的出芽始于HA和NA在脂筏區(qū)域的聚集，聚集可能導(dǎo)致了膜的變形以及病毒出芽的開始，隨后M1結(jié)合到HA和NA的胞質(zhì)尾，招募病毒RNPs[10]，M2并不和脂筏相聯(lián)系，而是和HA在質(zhì)膜區(qū)域相聚集，M1在其中起到了橋梁的作用[25]，M2和M1的相互作用位點為氨基酸殘基70～77[10]。M2被招募到膽固醇豐富的脂筏區(qū)域，M2在此膽固醇豐富的區(qū)域不能誘導(dǎo)正膜彎曲，可能誘導(dǎo)負膜彎曲，負膜彎曲可能穩(wěn)定了HA和M1在出芽起始階段誘導(dǎo)的正膜彎曲，這種穩(wěn)定作用可能促進了絲狀病毒的形成，延長了病毒出芽過程，使得剩下的病毒蛋白和病毒基因組能夠被招募到脂筏區(qū)域[1]。

M2蛋白的積累，使得M2蛋白位于出芽病毒的頸部，此區(qū)域位于出芽病毒的脂質(zhì)有序相和塊狀質(zhì)膜的無序相之間的邊界，該區(qū)域膽固醇相對較少，M2蛋白介導(dǎo)了從質(zhì)膜的低膽固醇區(qū)域在體內(nèi)的出芽，這是一種依賴于M2蛋白胞質(zhì)尾近膜區(qū)兩性螺旋的方式，在此低膽固醇區(qū)域，兩性螺旋插入膜，改變了脂質(zhì)無序相和脂質(zhì)有序相之間的線性張力，這為膜彎曲提供了動力，質(zhì)膜隨即發(fā)生正膜彎曲，導(dǎo)致了質(zhì)膜的分離[1]。在出芽的最后，出芽病毒的HA依然與感染細胞上的唾液酸糖鏈相連，病毒包膜上的NA水解唾液酸與糖鏈之間的糖苷鍵，最終導(dǎo)致了子代病毒的釋放[10]。endprint

5 M2蛋白與自噬及凋亡

自噬是一種能使細胞在不同壓力條件下存活的機制，涉及溶酶體降解的胞質(zhì)蛋白和細胞器的再循環(huán)利用，自噬能夠為維持和修復(fù)宿主細胞的重要功能提供營養(yǎng)[26]。Gannagé等[27]發(fā)現(xiàn)M2蛋白能夠抑制自噬體的降解，通過N端60個氨基酸抑制自噬體和溶酶體的融合，導(dǎo)致了不成熟自噬體的蓄積，對比巨自噬缺陷和有巨自噬能力的細胞發(fā)現(xiàn)，巨自噬缺陷的細胞病毒蛋白和病毒RNA釋放增加，而有巨自噬能力的細胞情況相反，RNA可引起炎性細胞因子的釋放，因此，M2阻止了自噬體和溶酶體的融合，導(dǎo)致了不成熟自噬體的積累，而這些自噬體可以保留大部分的病毒RNA和病毒蛋白，限制了它們的釋放，減輕了由病毒RNA釋放引起的炎性反應(yīng)和病毒蛋白釋放引起的免疫反應(yīng)，從而有利于病毒復(fù)制。M2除了干擾自噬體和溶酶體的融合來干擾自噬外，還可以通過M2胞質(zhì)尾的LIR模體來操控自噬機制，LIR模體在M2胞質(zhì)尾高度保守，能和自噬蛋白LC3直接相互作用，將LC3定位至質(zhì)膜，自噬體靠近LC3所在的質(zhì)膜，可能為病毒出芽提供合適的能源，進一步研究發(fā)現(xiàn)M2胞質(zhì)尾的F91xxI94模體與LIR模體高度吻合[28]。

M2蛋白不僅與自噬有關(guān)，與凋亡也有聯(lián)系。流感病毒的復(fù)制在感染細胞中引起了兩階段的反應(yīng)：在早中期階段的抗凋亡反應(yīng)和晚期階段的誘導(dǎo)凋亡反應(yīng)[26]。在感染后的早期及中期，為了使宿主細胞存活，促進病毒的復(fù)制，病毒蛋白NS1通過與PI3K-AKT復(fù)合物相互作用下調(diào)了凋亡；而在感染的晚期，M2蛋白則是通過調(diào)控PKR信號通路來控制細胞凋亡的，M2能和p58及Hsp40相互作用，Hsp40是PKR信號通路的一個調(diào)控因子，它能與一種抑制PKR的細胞抑制因子p58（IPK）相互作用來調(diào)控PKR信號通路，M2通過與Hsp40和P58（IPK）形成一個穩(wěn)定的復(fù)合物，抑制Hsp40-P58（IPK）的分離，最終導(dǎo)致了PKR的活化，誘導(dǎo)了細胞凋亡，從而控制病毒的復(fù)制[29]。

6 小結(jié)

歷史上曾多次暴發(fā)流感大流行，對人類及家畜等造成了嚴重危害，而近年來出現(xiàn)的新H1N1、H5N1和H7N9等不同亞型造成的損失更是無法估量，疫苗及藥物的研究是目前防控流感的主要措施，而M2蛋白由于其保守性和自身特性而成為疫苗及藥物研究的熱門。對類病毒顆粒疫苗的研究，由于其高效及安全性，有望成為M2疫苗研究的重點，而最近發(fā)現(xiàn)的具有中和活性的單結(jié)構(gòu)域M2抗體，則為發(fā)展新型M2抗體提供了新思路，鑒于M2蛋白在質(zhì)子傳導(dǎo)、藥物作用、出芽等過程中所起的作用，開發(fā)針對性的藥物有助于病毒感染的控制。

疫苗及藥物的研究離不開M2蛋白結(jié)構(gòu)及其功能機制的探索，雖然近年來M2蛋白的研究不斷深入，但仍有許多問題有待進一步的研究，比如，如何發(fā)展能用于實際預(yù)防的基于M2的“通用疫苗”？基于M2的新型抗耐藥性藥物的研究？M2協(xié)調(diào)自噬和凋亡的確切機制？相信隨著新技術(shù)與新方法的不斷出現(xiàn)與應(yīng)用，這些問題能被合理地闡述與解決，為流感的預(yù)防與治療提供基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-08-02 本文編輯：張瑜杰）endprint