一株鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗

張穎

2016年11月山東省某豬場發(fā)生了一種以出血性敗血癥、心包積液為主要特征的傳染病。該病發(fā)病突然，病程急，發(fā)病豬出現體溫升高、精神沉郁、呼吸困難、結膜發(fā)紺，口鼻有泡沫狀液體流出及病豬倒地不起等癥狀，發(fā)病急，來不及用藥就出現死亡，給發(fā)病的豬場造成嚴重的經濟損失。采集死亡病豬肝脾及心包積液等病料經實驗室進行細菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色、生化特性鑒定、玻片凝聚試驗、藥敏試驗及動物回歸試驗，并經PCR檢測確定為豬鏈球菌感染?，F報告如下：

1材料與方法

1.1主要試驗材料

病料為從山東省幾個豬場采集的疑似豬鏈球菌感染的病豬病料，體重為18～20g的健康小鼠購自河南大學實驗動物中心。

1.2主要試劑

TaqDNA聚合酶、dNTPs及DNA Marker DL2000等購自大連寶生物工程有限公司；膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。改良馬丁肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉等試劑購自北京索萊寶科技有限公司；豬鏈球菌的標準陽性血清、藥敏紙片購自北京天壇生物公司；細菌生化反應管購自杭州天和微生物試劑有限公司；其他化學試劑如氯仿、異丙醇和乙醇等，均為國產分析純產品。

1.3細菌的分離培養(yǎng)

無菌取發(fā)病豬的肝臟及心包積液用接種環(huán)劃線接種于含5%綿羊血的馬丁肉湯瓊脂平板上，放置于37℃的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，觀察生長情況及菌落特征。挑取疑似菌落涂片并進行革蘭氏染色，鏡檢。觀察細菌形態(tài)及溶血情況。

1.4細菌的生化鑒定

將所分離細菌純化培養(yǎng)后接種于馬丁肉湯瓊脂平板上，放置于37℃的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)36h，觀察是否有溶血現象。挑取生長良好的單菌落轉移接種于各個微量生化反應管，根據杭州天和微生物試劑有限公司說明書進行，觀察生化反應特性，鑒定結果。

1.5玻板凝集試驗

將分離鑒定的疑似豬鏈球菌的分離菌落接種改良馬丁肉湯培養(yǎng)基，37℃的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，取1.0mL培養(yǎng)菌液，4，000r/min離心5min，棄上清，用適量PBS懸浮沉淀，取20μL懸浮菌液與等體積的無菌PBS、豬鏈球菌2型陽性血清進行玻片凝集試驗，同時設PBS空白對照進行陰性對照。

1.6藥敏試驗

無菌條件下對分離細菌培養(yǎng)物利用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗，將分離的豬鏈球菌接種在改良馬丁肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后無菌挑取單菌落后均勻涂布普通瓊脂平板，用滅菌鑷子夾取青霉素、阿莫西林和紅霉素等各種藥敏紙片貼在適當的位置，將培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)24h觀察測定抑菌圈的大小，判斷對不同藥物敏感性。

1.7細菌的致病性動物回歸試驗

將純化的分離菌、增菌接種到改良馬丁肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～24 h制成細菌懸液，接種8只健康的健康小白鼠，隨機分成2組，每組4只，第1組小鼠腹腔注射0.5mL/只，第2組腹腔注射馬丁肉湯培養(yǎng)基作為對照組。觀察實驗小鼠的發(fā)病情況，剖檢死亡小鼠觀察病理變化，取病料鏡檢。

1.8細菌的PCR鑒定

從GenBank中豬鏈球菌序列，參照文獻中16srRNA通用引物進行PCR擴增，擴增產物大小為1，150bp，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結果與分析

2.1細菌的分離培養(yǎng)

取病變肝臟研磨后接種培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)36h后，觀察菌落特征，其表面光滑濕潤，邊緣有整齊的乳白色圓形小菌落，且有顯著溶血環(huán)。革蘭染色鏡檢可見呈鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌。

2.2細菌的生化鑒定

本實驗生化試驗結果表明：分離的鏈球菌糖發(fā)酵特性活潑，能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖和蔗糖等，產酸不產氣；且該分離菌不能發(fā)酵木糖、半乳糖、甘露和山梨醇等；氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗為陰性，甲基紅試驗、亞甲藍還原試驗結果呈陽性。

2.3玻板凝集試驗結果

分離的鏈球菌與購買的豬鏈球菌標準陽性血清玻板凝集試驗結果為陽性，陰性對照無凝集。

2.4藥敏試驗結果

試驗結果：該分離株鏈球菌對不同抗生素藥物的敏感程度不同，該菌株對氨芐西林、青霉素、諾氟沙星和頭孢噻肟高敏；對環(huán)丙沙星、氧氟沙星和慶大霉素中敏；而對林可霉素和鏈霉素不敏感，具有耐藥性。

2.5細菌的致病性動物回歸試驗

將分離的鏈球菌腹腔接種健康小鼠后，第1組小鼠出現神經癥狀，均在24～72h內死亡，對照組小鼠無明顯臨床癥狀。剖檢死亡小鼠出現出血性敗血癥、心包積液等特征，頜下及腹股溝淋巴結腫大。取其心包積液涂片染色鏡檢為革蘭氏陽性球菌。2.6分離菌的PCR鑒定

提取分離菌株的DNA為模板，以不加模板為陰性對照，通過特異性的16srRNA通用引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳可見1，150bp左右的特異條帶，與預期目的條帶位置一致，陰性對照未見條（圖1）。

3討論

近年來，隨著世界養(yǎng)豬業(yè)集約化發(fā)展，豬鏈球菌病呈上升趨勢，已成為嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的典型細菌性疾病，給我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了巨大的經濟損失，同時該病作為人畜共患傳染病還給公共衛(wèi)生安全帶來了嚴重威脅。根據臨床癥狀、典型病理變化以及病原菌的分離鑒定可以進行副豬嗜血桿菌感染的診斷。本試驗中分離的病原菌從培養(yǎng)特性、染色鏡檢、溶血特性及生化特性等都符合豬鏈球菌的生物學特性。將分離菌的培養(yǎng)產物接種小鼠，出現該病

典型癥狀，動物回歸試驗證實該菌具有較強的致病性，同時PCR檢測證實了該分離菌為豬鏈球菌。endprint