microRNA-200c在胰腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)及作用研究

區(qū)泳芳 謝健龍

胰腺癌細(xì)胞微小核糖核酸microRNA-200c是在胰腺癌疾病患者的生理及病理的過程當(dāng)中發(fā)揮著調(diào)控作用的一種物質(zhì)[1-2]。當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究上，對多種的腫瘤組織當(dāng)中都能發(fā)現(xiàn)microRNA表達(dá)譜出現(xiàn)異常的改變情況，許多研究者認(rèn)為microRNA與腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤的預(yù)后存在密切關(guān)聯(lián)。此外，對于胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，胰腺癌因過強(qiáng)的侵襲性常常影響到預(yù)后[3-5]。在腫瘤的干細(xì)胞理論當(dāng)中認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移存在密切的關(guān)系，甚至其可能是導(dǎo)致惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移的一個原因[6-7]。本研究通過分選人胰腺癌的干細(xì)胞，分析microRNA-200c的表達(dá)與作用，研究成果作以下報道。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌的PANC-1細(xì)胞株（上海生物化學(xué)與生物學(xué)研究所）。NOD/SCID鼠（北京華阜康生物科技股份有限公司）。3450 Transwell小室（北京明陽科華生物科技有限公司）。抗人CD24-PE、CD44-APC、ESA-FITC流式熒光抗體（BD公司，美國）。流式細(xì)胞儀（貝克曼庫爾特公司，美國）。熒光定量PCR儀（7700，Applied Biosystems公司，美國）。PCR擴(kuò)增試劑盒（生工生物工程股份有限公司）。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。轉(zhuǎn)染試劑盒劑（Ambion公司，美國）。

1.2 腫瘤干細(xì)胞的分選

選擇處于生長期的PANC-1細(xì)胞數(shù)對，先使胰酶消化，后進(jìn)行離心5 min。DMEM的培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，并將濃度調(diào)整至1×106個/ml。以1 ml的細(xì)胞懸液配20 μL的抗人CD24-PE、CD44-APC、ESA-FITC，置于常溫避光孵育處理30 min，高速離心機(jī)下進(jìn)行8 min離心，分離上清液，并經(jīng)過磷酸鹽溶液清洗后重新制作成單細(xì)胞的懸液。完成懸液制作后采用流式細(xì)胞儀對各成分比例進(jìn)行檢測并分選[7-8]。

1.3 成瘤能力分析與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將新鮮分選后對抗人CD44+ESA+CD24+細(xì)胞與PANC-1細(xì)胞計數(shù)，并隨機(jī)選取20只NOD/SCID鼠隨機(jī)分兩組，每組各10只，每只NOD/SCID鼠皮下接種5×105個細(xì)胞。觀察分析NOD/SCID鼠成瘤能力。后將microRNA-200c前體片段以及陰性的對照片段轉(zhuǎn)染到NOD/SCID鼠的干細(xì)胞中。

1.4 microRNA-200c表達(dá)檢測

重新對PANC-1細(xì)胞、轉(zhuǎn)染microRNA-200c前體片段后NOD/SCID鼠胰腺癌的干細(xì)胞等進(jìn)行分選，對細(xì)胞的總RNA進(jìn)行提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

cDNA合成采用特異性引物microRNA-200 RT對反轉(zhuǎn)錄的體系進(jìn)行構(gòu)建，并以cDNA為模板，利用microRNA-200c特異性引物進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，并利用PCR擴(kuò)增試劑盒分析ct值，取得PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

研究采取SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。其中計量資料采用（進(jìn)行表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOD/SCID鼠胰腺癌干細(xì)胞分選結(jié)果

NOD/SCID鼠的瘤移植驗(yàn)證PANC-1細(xì)胞中分選胰腺癌干細(xì)胞具腫瘤干細(xì)胞的特性，瘤移植鼠的皮下胰腺癌干細(xì)胞瘤體積（1673.56±258.77）mm3大于移植同期的PANC-1細(xì)胞瘤體積（482.41±96.44）mm3。

2.2 microRNA-200c表達(dá)與侵襲能力

NOD/SCID鼠microRNA-200c表達(dá)量上，胰腺癌干細(xì)胞表達(dá)值（0.14±0.01）%低于PANC-1細(xì)胞表達(dá)值（0.98±0.11）%，microRNA-200c前體片段轉(zhuǎn)染后24 h，胰腺癌干細(xì)胞中microRNA-200c表達(dá)量為3.52±0.51，高于轉(zhuǎn)染陰性對照（0.24±0.19）%。平均穿膜的細(xì)胞數(shù)上，胰腺癌干細(xì)胞（311.00±6.93） 個 多 于 PANC-1細(xì) 胞（73.00±17.11） 個，microRNA-200c前體片段轉(zhuǎn)染后24 h，microRNA-200c轉(zhuǎn)染胰腺癌干細(xì)胞平均穿膜的細(xì)胞（80±12.63）個，而轉(zhuǎn)染陰性對照為（309±13.53）個。轉(zhuǎn)染microRNA-200c前體片段后，胰腺癌干細(xì)胞microRNA-200表達(dá)量上升，平均穿膜的細(xì)胞數(shù)上明顯降低（P＜0.05）。

3 討論

本研究通過對人的胰腺癌細(xì)胞系在PANC-1中進(jìn)行分選，獲得抗人CD44+ESA+CD24+細(xì)胞，并接種NOD/SCID鼠進(jìn)行瘤移植實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證PANC-1細(xì)胞中分選胰腺癌干細(xì)胞具腫瘤干細(xì)胞的特性，瘤移植鼠的皮下胰腺癌干細(xì)胞瘤體積（1673.56±258.77）mm3大于移植同期的PANC-1細(xì)胞瘤體積（482.41±96.44）mm3。而通過細(xì)胞體外侵襲的能力檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染microRNA-200c前體片段后，胰腺癌干細(xì)胞microRNA-200c表達(dá)量上升，平均穿膜的細(xì)胞數(shù)上明顯降低，胰腺癌的干細(xì)胞侵襲能力遠(yuǎn)比PANC-1細(xì)胞更高，研究表明了胰腺癌干細(xì)胞參與到胰腺癌侵襲過程。

綜上所述，microRNA-200c在胰腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)降低，microRNA-200c能夠?qū)σ认侔┑母杉?xì)胞生長與減弱侵襲起到抑制的作用。

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