酶催化光度法測定藥物中的雙嘧達莫

王 帆,梅玉強,朱文平,3,陳超華,陳亞紅,3*

雙嘧達莫(Dipyridamole),又名潘丁生,為含氮雜環(huán)的嘧啶類合成藥物,對冠狀血管有較強的擴張作用,可以顯著增加冠狀脈流量,增加心肌供氧量,并能抑制血小板凝聚,又防止血栓的形成,臨床上用于心絞痛、心肌梗塞和冠心病的預防和治療[1].因此,尋求簡便、快速、靈敏的雙嘧達莫測定方法意義重大.

目前,關于雙嘧達莫的測定方法主要有紫外-可見分光光度法[2]、熒光光譜法[3]、電化學測定法[4]、化學發(fā)光分析法[5,6]和高效液相色譜法[7]等.在臨床、農(nóng)業(yè)、藥物、工業(yè)過程檢測中,酶催化光度分析法都具有十分廣泛的應用[8],采用酶催化光度法測定藥物中的雙嘧達莫未見相關文獻報道.

在p H 9.8的NH-3NH4Cl的緩沖溶液中,雙嘧達莫對血紅蛋白酶催化體系有較強的抑制作用,據(jù)此建立了測定雙嘧達莫的酶催化光度分析的新方法.該分析方法設備簡單,可操作性強,適合于藥劑中雙嘧達莫含量的測定,結(jié)果令人滿意.

1 實驗部分

1.1 設備與試劑

S-22PC型分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司);UV-530型紫外-可見分光光度計(日本分光公司);電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司);p HS-3C型酸度計(上海理達儀器廠).

牛血紅蛋白(美國Sigma公司);酸性鉻藍K(北京化學試劑廠);H2O2溶液.

雙嘧達莫(天津一方科技有限公司)標準溶液:準確稱取雙嘧達莫0.100 0 g,用適量0.01 mol/L的鹽酸溶解轉(zhuǎn)移至100 m L容量瓶中,定容,作為儲備液,儲備液質(zhì)量濃度為1.0 mg/m L.工作液:用水逐級稀釋成100μg/m L,現(xiàn)配現(xiàn)用.

所用試劑均為分析純,水均為二次蒸餾水.

1.2 實驗方法

在一系列10 m L比色管中按順序加入p H=9.8的NH3·H2O-NH4Cl緩沖溶液2.0,2.2 m L濃度為2.0×10-4mol/L的酸性鉻藍K溶液,0.9 m L濃度為1.0×10-3mol/L的H2O2溶液,不同濃度的雙嘧達莫標準溶液,2.5 m L濃度為5.0×10-6mol/L的牛血紅蛋白溶液,用水定容.室溫下靜置15 min,選擇1 cm比色皿,水為參比,于543 nm下測量溶液的吸光度.當溶液中無牛血紅蛋白和雙嘧達莫時吸光度為A0,當溶液中無雙嘧達莫時吸光度為A1,當溶液中有雙嘧達莫時吸光度為A2,其抑制率I=(A2-A1)/(A0-A1)×100%,用所得抑制率對雙嘧達莫的濃度作標準曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜

血紅蛋白能夠催化H2O2與酸性鉻藍K的氧化反應.研究發(fā)現(xiàn),雙嘧達莫對此光度體系有強烈的抑制作用,吸收光譜如圖1所示,最大吸收波長λem=543 nm.由圖1可知,雙嘧達莫的加入能夠顯著的抑制該體系的吸光度.

2.2 測定條件的優(yōu)化

2.2.1 酸度

通過實驗分別考查了不同p H的NH3·H2O-NH4Cl緩沖溶液介質(zhì)的影響.實驗結(jié)果表明:在p H=9.8的緩沖溶液介質(zhì)中,雙嘧達莫對光度體系的抑制作用最強.因此,實驗中選擇p H為9.8的NH3·H2O-NH4Cl緩沖溶液.

圖1 體系的吸收光譜圖

2.2.2 酸性鉻藍用量

分別試驗了不同用量的酸性鉻藍K溶液對光度體系的影響.實驗結(jié)果表明:當酸性鉻藍K溶液的用量逐漸增大時,吸光度逐漸增大.當酸性鉻藍K溶液的用量為2.2 m L時抑制程度最大.當酸性鉻藍K溶液的用量超過2.2 m L時,抑制程度又逐漸減小.所以,酸性鉻藍K溶液的最佳實驗用量為2.2 m L.

2.2.3 H2O2用量

分別試驗了不同用量的H2O2溶液對抑制體系的影響.結(jié)果表明:當H2O2用量逐漸增大時,雙嘧達莫對體系的抑制程度也逐漸增大.在H2O2的用量為0.9 m L時,抑制率出現(xiàn)最大值.當H2O2的用量超過0.9 m L時,抑制率反而逐漸減小.因此,H2O2溶液的最佳實驗用量為0.9 m L.

2.2.4 血紅蛋白用量

分別試驗了不同用量的血紅蛋白對光度體系的影響.實驗表明:當血紅蛋白溶液的用量逐漸增大時,雙嘧達莫對光度體系的抑制作用也逐漸增大,當血紅蛋白溶液的用量為2.5 m L時,雙嘧達莫對光度體系的抑制作用最強,隨后又逐漸減小.因此,血紅蛋白溶液的最佳實驗用量為2.5 m L.

2.2.5 反應時間

隨著雙嘧達莫濃度的逐漸增大,其對光度體系的抑制作用也逐漸增強;同時發(fā)現(xiàn),當反應時間不斷延長時,反應速度逐漸減慢,當在室溫下反應15 min后,體系逐漸平衡.所以,15 min作為實驗的最佳反應時間.

2.3 分析方法特性

雙嘧達莫的質(zhì)量濃度在1.2～29.2μg/m L內(nèi)與其抑制率I有良好的線性關系.其線性回歸方程為:

I%=29.879 1+2.066 1 C(r=0.991 4,n=8)檢出限為0.06μg/m L.當雙嘧達莫的濃度為3.5 μg/m L時,11次平行測定的相對標準偏差為2.3%.

2.4 共存物質(zhì)影響

在相對標準誤差不大于±5.0%的條件下,考查了十幾種常見物質(zhì)對質(zhì)量濃度為3.5μg/m L的雙嘧達莫的干擾情況,如表1所示.由此可見,上述離子均不干擾測定.

表1 共存物質(zhì)的影響

2.5 樣品分析

取雙嘧達莫片20片,除去包衣后,研細,準確稱取適量,置100 m L量瓶中,加0.01 mol/L的鹽酸溶液適量,搖勻使雙嘧達莫溶解,定容,搖勻,過濾.分別量取處理后的濾液和稀釋后的雙嘧達莫注射液按上述方法進行分析.將上述樣品同時進行了對照實驗[1],并將兩種方法的測定結(jié)果進行了統(tǒng)計處理,結(jié)果見表2.表中數(shù)據(jù)表明,此法的結(jié)果與標準方法測定結(jié)果不存在顯著性差異.

表2 樣品分析結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

利用在堿性介質(zhì)中,血紅蛋白酶能夠催化酸性鉻藍K,而雙嘧達莫對催化體系具有較強的抑制作用.據(jù)此,建立了測定雙嘧達莫的酶催化光度分析的新方法,測定檢出限為0.06μg/m L.該方法容易操作、選擇性較好,可用于藥劑中雙嘧達莫含量的測定,結(jié)果滿意.

參考文獻:

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