美國FDA對基于NGS技術(shù)檢測疑似遺傳病lVD的監(jiān)管及啟示

吳傳松 史裕英 國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心 （北京 100044）

內(nèi)容提要： 目的：探討美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）對基于NGS平臺檢測疑似遺傳病IVD的性能評價要求，為我國相關(guān)從業(yè)人員提供參考和借鑒。方法：通過介紹FDA發(fā)布的涉及NGS平臺檢測疑似遺傳病IVD研究的指導(dǎo)原則，了解FDA對NGS平臺檢測疑似遺傳病IVD的評價要求，從而在此方面為我國相關(guān)監(jiān)管部門起到借鑒作用。結(jié)果：相關(guān)監(jiān)管部門在評價基于NGS平臺檢測疑似遺傳病IVD時，需考慮采用更加創(chuàng)新靈活的技術(shù)審評方式并注重產(chǎn)品在設(shè)計、開發(fā)和驗證各環(huán)節(jié)研究和評價方式。結(jié)論：我國目前沒有同類指導(dǎo)原則，相關(guān)監(jiān)管部門可借鑒FDA評價基于NGS平臺檢測疑似遺傳病IVD研究的經(jīng)驗，結(jié)合我國相關(guān)法規(guī)要求和實際情況，期望對促進我國同類產(chǎn)品的研究與監(jiān)管模式能有所幫助。

新一代測序技術(shù)的基因組檢測可以一次檢測幾十或百萬個DNA變異體，并有可能檢測到以前未識別的變異體，而傳統(tǒng)的檢測方法通常是檢測與某一疾病或病癥相關(guān)的有限數(shù)量的分析物。目前臨床中，該類產(chǎn)品在腫瘤相關(guān)突變檢測、遺傳性疾病、無創(chuàng)產(chǎn)前檢測以及胚胎植入前遺傳學診斷等領(lǐng)域備受關(guān)注，針對該類產(chǎn)品特點以及促進新技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用需求，需要建立科學合理的監(jiān)管方法來評價這類檢測的新穎性和靈活性。近年來，F(xiàn)DA一直在探索更靈活、有效、合理的監(jiān)管方式，2013年FDA批準了基于NGS測序平臺的Illumina MiSeqDx囊性纖維化基因檢測試劑和MiSeqDx囊性纖維化測序分析儀。2014年，F(xiàn)DA開始發(fā)布關(guān)于基于NGS技術(shù)的檢測產(chǎn)品的監(jiān)管模式的討論性文件，此后又多次召開相關(guān)的研討會，也有少量基于NGS檢測技術(shù)相關(guān)的產(chǎn)品獲批。

FDA希望通過行業(yè)標準，質(zhì)量體系控制和臨床專家共識等規(guī)范對該類試劑的研發(fā)和驗證，在保障其安全性和有效性的基礎(chǔ)上，簡化上市前審查流程。為實現(xiàn)這一目標，2018年4月FDA發(fā)布了基于NGS技術(shù)用于輔助檢測疑似遺傳性疾病試劑的設(shè)計，開發(fā)和分析的指導(dǎo)原則，概述了該類產(chǎn)品在設(shè)計、開發(fā)和分析有效性研究過程中的關(guān)鍵考慮因素[1]。該指南主要用于對疑似遺傳病患者即具有相關(guān)臨床癥狀的人群的檢測，不用于健康人體測序、產(chǎn)前篩查、腫瘤突變檢測、胚胎植入前檢測等領(lǐng)域。本文將從以下幾個方面對該指導(dǎo)原則進行介紹。

1.基于NGS測序原理的體外診斷試劑概述

基于NGS測序原理的IVD檢測可能包括以下步驟：樣本收集，處理和存儲、DNA提取、DNA處理和文庫制備、序列讀取和堿基識別、序列比對/映射、變異體識別和過濾、變異體注釋和評估以及檢測報告的生成。同時，某些產(chǎn)品還可能會包括軟件部分，但上述相關(guān)步驟并不一定被全部包括，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的具體設(shè)計流程來進行判斷。對于每個檢測步驟，申請人需要結(jié)合產(chǎn)品設(shè)計和臨床意義建立特定可接受的評價指標和驗收標準。此外，為滿足產(chǎn)品特定預(yù)期用途，申請人需通過科學和適當?shù)男阅苎芯縼泶_定適用的試劑，消耗品，儀器和軟件?；谏鲜隹紤]因素，不同NGS檢測試劑的設(shè)計和工作流程差異均可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不同。FDA建議申請人在檢測的開發(fā)過程中盡可能早地通過審評前溝通程序討論其申報產(chǎn)品。

2.設(shè)計、開發(fā)和驗證要求

作為IVD檢測一般原則，申請人應(yīng)首先定義申報產(chǎn)品的預(yù)期用途和檢測性能，產(chǎn)品的預(yù)期用途將直接影響檢測設(shè)計和檢測性能以及測序和/或報告的基因類型[2]。申請人需要確定應(yīng)進行的研究指標（例如準確性）以及每種研究指標應(yīng)該滿足的標準。在設(shè)計和開發(fā)完成之后，驗證研究其是否滿足預(yù)定義的性能。如果檢測不符合任何預(yù)定義的性能標準，則應(yīng)該修改并重新驗證。在整個過程中，申請人需要記錄所有研究方案，研究過程和結(jié)果，以及每項研究設(shè)置的理由。

申請人應(yīng)確定申報產(chǎn)品所適用具體臨床適應(yīng)癥，確定滿足檢測所需的特定用戶需求以及可接受樣本類型。其中，需考慮到檢測的樣本類型對測序可能產(chǎn)生的影響，如所需采集工具的類型，樣本的最小體積或數(shù)量，或其他任何影響樣本穩(wěn)定性的采集因素。多種樣本和采集方式可能適用于同一檢測，但每種樣本和采集方式都需要進行充分驗證。確定并記錄基因組的檢測區(qū)域，包括基因和變異體類型，如果關(guān)鍵的測序區(qū)域不符合最低性能要求（例如最小覆蓋標準），則應(yīng)修改檢測并重新驗證以達到最低性能要求。同時，應(yīng)在產(chǎn)品說明書和/或標簽中明確可能影響或限制產(chǎn)品檢測性能情形。

檢測方法中，需明確所有檢測要素（例如，儀器、軟件、消耗品、試劑）和用于檢測的實驗室設(shè)備的檢測要素[3]。確定設(shè)計方案和標準并詳細記錄設(shè)計研究過程。在某些情況下，檢測設(shè)計問題可能在預(yù)定義的性能驗證過程中被發(fā)現(xiàn)，申請人需修改產(chǎn)品說明書明確因測序平臺選擇而造成的限制因素。

申請人需選擇合適的測序平臺、質(zhì)控品和參考品以及數(shù)據(jù)處理和分析流程等。根據(jù)測序類型和檢測報告的變異體類型選擇生物信息流程，并考慮變異體識別和評估流程過程中的限制因素。納入第三方生物信息學軟件的檢測設(shè)計應(yīng)通過記錄和驗證生物信息學軟件在NGS的檢測環(huán)境中的運算表現(xiàn)。詳細記錄運行檢測的過程和方法，每個檢測步驟的方法，使用儀器，消耗品，試劑和支持方法的程序。如適用，確認每一步的限制，包括對其他步驟的潛在影響。以及使用的測序類型，例如，單端/雙端/配對測序。對于基于NGS的檢測所需的每種方法，應(yīng)確定研究性能和試驗過程。

3.分析性能研究

分析性能驗證包括通過一組預(yù)定義性能評價方式，以證明性能是否足以滿足其預(yù)期用途并符合預(yù)定義的性能標準。通常涉及是否符合統(tǒng)計學評價要求，或檢測是否存在關(guān)于患者的疾病或其他病癥信息的變異體等。

3.1 準確性

準確性包括對比檢測值與被檢測值之間一致性。對于基于NGS測序原理的檢測，通過與FDA確定為適當?shù)膶Ρ确椒ū容^，如雙向測序或其他經(jīng)過驗證的方法，評估申報產(chǎn)品準確性能。

通過陽性百分比一致性（PPA），陰性百分比一致性（NPA）和技術(shù)陽性預(yù)測值（TPPV）證明試劑準確性。為PPA，NPA和TPPV設(shè)置評價指標，以確保檢測滿足其預(yù)定義的性能范圍。通過檢測評估的每種類型的變異體（如：SNV、插入、結(jié)構(gòu)變異體）和測序區(qū)域范圍（如：高度同源、高度多態(tài)或其他困難的區(qū)域）分別計算PPA，NPA和TPPV。

對于每種變異類型以及臨床相關(guān)變異體，均應(yīng)計算準確度。對于變異體類型，為了確定檢測的變異體類型以及檢測它們的測序區(qū)域（不管變異體是否具有致病性），可以使用具有代表性的參考物質(zhì)或具有高置信度的樣本進行研究。對于臨床相關(guān)的變異體，準確性計算包含使用基于臨床樣本的研究數(shù)據(jù)與臨床樣本相關(guān)的指標。

根據(jù)檢測的性能指標，準確性研究應(yīng)包括代表性變異體和變異體類型。研究應(yīng)考慮與檢測適應(yīng)癥相關(guān)的臨床意義區(qū)域、跨不同基因組的變異體、基因組難以測序或難以辨識的區(qū)域、嵌合體以及任何其他變異體類型、區(qū)域或被測區(qū)域范圍等。

準確性研究中應(yīng)含有臨床相關(guān)變異體與檢測適應(yīng)癥的臨床樣本，以確保臨床相關(guān)序列變異被檢測和報告。準確性評估如采用新鮮臨床樣本時，收集和處理的方式應(yīng)與產(chǎn)品預(yù)期用途一致。如果新鮮的臨床樣本不可用，則可以使用臨床相關(guān)區(qū)域中含有特定變異體的凍存臨床樣本或人類細胞系樣本替代或補充研究。特殊情況下，如果FDA認為合適，也可以使用生物合成樣品作為可接受的替代樣本。

3.2 精密度

申請人應(yīng)評估變異體和野生型基因的精密度，其中應(yīng)分別報告不同檢測區(qū)域和變異體類型的檢測指標值。申請人應(yīng)使用客觀證據(jù)和有效的統(tǒng)計方法來驗證這些指標設(shè)定標準。對可能導(dǎo)致檢測結(jié)果多樣性的主要因素進行評價，包括但不限于檢測多個樣本，不同運行間、不同適用機型、試劑批次、檢測天數(shù)和操作員。

基于NGS技術(shù)的IVD檢測的精密度研究主要是指使用相同的樣本（包括檢測臨界值附近的樣本）在各種特定條件下進行檢測（如不同操作員，不同操作條件，不同檢測天數(shù)，不同儀器等），并考慮了檢測中主要的變異來源。此外，在外部因素相同的情況下，應(yīng)進行申報試劑在相同或相似被測物的重復(fù)性檢測以評價檢測結(jié)果的變異程度。申請人需對每個檢測條件和檢測區(qū)域下每個變異體類型精密度分別進行報告，還應(yīng)報告沒有應(yīng)答或無效應(yīng)答的百分比。

3.3 最低檢出限

明確可接受的最低檢測范圍，并明確無效檢測或無應(yīng)答檢測結(jié)果可接受標準。為預(yù)期用途中包含的每種變異體類型建立LoD。如果檢測混合的樣本（如嵌合樣本），需要考慮不同的等位基因比率，確定檢測下限。

試劑LOD的研究中應(yīng)在不同的常規(guī)臨床實驗室條件和確定的樣本類型下進行。通常，LOD值被確立為具有至少95%的陽性檢出率和可接受水平的無效的或未檢測到的檢測水平。當不同的變異體類型可能具有不同的LoD時，需要計算不同的序列被測區(qū)域范圍中的每個變異體類型的LoD。

3.4 分析特異性

分析特異性是評估產(chǎn)品僅可檢測到預(yù)期待測變異體的能力。根據(jù)預(yù)期用途和產(chǎn)品設(shè)計，一些潛在的內(nèi)源性或外源性物質(zhì)干擾和交叉反應(yīng)或交叉污染可能會對產(chǎn)品檢測性能產(chǎn)生影響。交叉反應(yīng)（如同源區(qū)域，假基因和其他類型的交叉反應(yīng)序列）可能導(dǎo)致錯誤檢測，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果?；颊邩吮镜慕徊嫖廴究赡軐⑵渌徽５男蛄幸氲綑z測中，從而導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。因此，應(yīng)選擇產(chǎn)品預(yù)期用途所覆蓋樣本或樣本類型以及DNA提取方法中相關(guān)的干擾物質(zhì)開展研究。同時，應(yīng)對已知交叉反應(yīng)的等位基因和同源區(qū)域進行評估。此外，需要評估患者樣本之間的攜帶或交叉污染。特別注意的是，對于如WES類的檢測產(chǎn)品，考慮到許多基因區(qū)域在任何兩個樣本中都是相同的，可能需要對樣本之間的已知差異進行交叉污染評估。

4.檢測運行質(zhì)量指標

明確設(shè)計和檢測過程有關(guān)的覆蓋率，堿基質(zhì)量和其他檢測運行質(zhì)量指標的最低可接受標準。設(shè)置樣本和變異體質(zhì)量控制驗收標準，如reads數(shù)量，覆蓋率，評價標準。

檢測運行質(zhì)量指標用于判斷是否某個檢測運行、樣本或變異體識別可以被接受，或者在適用時確定是否應(yīng)增加補充研究進一步確認變異體識別。檢測運行質(zhì)量指標驗證應(yīng)包括具有臨床意義的基因組檢測，即有足夠證據(jù)證明致病變異體和疾病之間存在因果關(guān)系的基因和區(qū)域。此外，不能滿足檢測標準的變異體不應(yīng)該被報告。FDA強調(diào)應(yīng)明確樣本的接收和剔除標準、DNA濃度、加樣體積、質(zhì)量閾值等。并如實報告那些由于未能達到質(zhì)量閾值而未被檢測的區(qū)域。

5.其他性能評估研究要求

FDA在基于NGS測序原理的IVD性能評價時，還強調(diào)了一些值得特別關(guān)注的測序區(qū)域。對預(yù)期用途代表性的基因組區(qū)域，變異體類型及序列等進行驗證性研究，包括臨床相關(guān)目標基因。如產(chǎn)品預(yù)期用途包含需要檢測高度同源的、高度多態(tài)性的或其他檢測難度較大的區(qū)域，申請人應(yīng)對這些區(qū)域進行驗證。同時，對于某些變異類型，如大于某特定大小的插入或缺失突變或者重排，應(yīng)評估其檢測限制性。并確定檢測無法以預(yù)期的準確度和精密度檢測到的序列變化類型，研究中應(yīng)使用可以反應(yīng)真實待測的樣本類型。

確定所需樣本的數(shù)量和類型，以證明滿足預(yù)期用途的性能標準。樣本數(shù)量取決于申報產(chǎn)品的預(yù)期用途，被檢測和報告的變異體數(shù)量和類型，以及為支持該預(yù)期用途而必須滿足的關(guān)鍵性能參數(shù)。此外，還應(yīng)對預(yù)期用途相關(guān)的不同基因型（即野生型，雜合型，嵌合雜合型，純合型）的檢測性能進行評估。盡管沒有要求需要檢測某特定數(shù)量的基因組，或者來自不同患者的特定數(shù)量的樣本，但樣本的數(shù)量和類型應(yīng)該在統(tǒng)計學上證明可代表檢測的臨床適應(yīng)癥和變異體類型。

當臨床樣品、細胞系或生物合成材料不可用時，也可用計算機模擬構(gòu)建包含產(chǎn)品聲稱的各種類型的已知序列，以作為生物樣本的補充，用于評估生物信息過程。但是，這些數(shù)據(jù)文件應(yīng)來源于采用與檢測相同的預(yù)分析和檢測方法中，并詳細描述人工序列構(gòu)建的方式。

6.啟示

6.1 多渠道促進NGS評價標準建立

美國FDA在NGS產(chǎn)品性能評價過程中非常關(guān)注性能標準的建立和確認過程，并鼓勵臨床專家，行業(yè)專家與美國FDA共同探索建立NGS的評價方法，這為我國探索建立NGS性能標準提供了一種參考途徑。同時，根據(jù)產(chǎn)品特點可能需要涵蓋多種基因和變異體類型，但部分基因和變異體臨床突變豐度較低，如何有效收集代表性臨床樣本以及在何種情況下，可以采用其他來源樣本進行驗證等問題均需要進行科學的評定。因此，鼓勵臨床專家、行業(yè)專家跟審評部門合作建立符合國內(nèi)臨床應(yīng)用情形的NGS分析性能評價方法，鼓勵企業(yè)與臨床機構(gòu)，科研單位積極合作，建立能夠反映產(chǎn)品特性的性能評價標準。

申請人在研發(fā)該類產(chǎn)品時，應(yīng)綜合該產(chǎn)品臨床意義、性能特征等因素預(yù)定義該類產(chǎn)品預(yù)期用途和適用人群，因為分析性能項目的設(shè)計與上述因素關(guān)聯(lián)性較強；FDA在審評該類產(chǎn)品時，也特別強調(diào)分析性能評估的設(shè)計應(yīng)結(jié)合該產(chǎn)品的預(yù)期用途及適用的人群，使分析性能評估指標制定和評價更加貼近于臨床應(yīng)用。

6.2 強化溝通交流機制

美國FDA在評價基于NGS測序原理的IVD時，強調(diào)申請人在設(shè)計，開發(fā)和驗證過程中應(yīng)與FDA積極進行溝通與咨詢，F(xiàn)DA也在審查要求中明確部分指標應(yīng)經(jīng)FDA確認，如準確度方法學比對的方法選擇。盡量避免申請人選擇不合適的評價方法。2017年，國家食品藥品監(jiān)督管理總局全面推進醫(yī)療器械審評審批機制改革，貫徹落實中共中央辦公廳、國務(wù)院辦公廳印發(fā)《關(guān)于深化審評審批制度改革鼓勵藥品醫(yī)療器械創(chuàng)新的意見》（廳字[2017]42號），強化審評質(zhì)量管理體系建設(shè)，不斷提高審評審批質(zhì)量和效率。目前家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心也啟動了創(chuàng)新、優(yōu)先等審評前溝通交流機制[4]。在國家深化審評審批制度改革背景下，更優(yōu)化，更高效的審評溝通交流舉措將值得期待。

6.3 FDA監(jiān)管理念變化的啟示

NGS基因組檢測建立在越來越多的數(shù)據(jù)和快速發(fā)展的技術(shù)基礎(chǔ)之上，基于NGS技術(shù)的檢測基因數(shù)量也在不斷變化。需要科學合理的監(jiān)管方法來評價這類檢測的新穎性和靈活性。目前的監(jiān)管方法適用于檢測與疾病或病癥相關(guān)的有限數(shù)量的預(yù)定義分析物的常規(guī)檢測，因此FDA考慮在保證該類產(chǎn)品安全性和有效性的前提下，采用優(yōu)化的方法來監(jiān)管基于NGS測序原理的檢測試劑，以支持快速發(fā)展的新技術(shù)在基因組醫(yī)學的應(yīng)用。

美國FDA針對NGS測序技術(shù)特點，采用一種不同于傳統(tǒng)局限于有限被測物的檢測方法，采取靈活的，更加開放態(tài)度的監(jiān)管手段，為我國同類產(chǎn)品技術(shù)審評提供了參考價值。我國對測序技術(shù)運用在生物領(lǐng)域非常重視，科技部2018年5月科技部制定了《“十三五”生物技術(shù)創(chuàng)新專項規(guī)劃》在重點任務(wù)的顛覆性技術(shù)部分，明確指出發(fā)展新一代基因測序技術(shù)，重視單分子技術(shù)在其中的應(yīng)用和測序數(shù)據(jù)的分析解讀。

對于基于NGS技術(shù)的IVD產(chǎn)品，優(yōu)化醫(yī)療器械審評工作方式是擺在醫(yī)療器械審評部門的一個重要課題，借鑒各國醫(yī)療器械審評機構(gòu)的審評實踐經(jīng)驗，并對這些信息資源積累和利用是提高醫(yī)療器械注冊審評工作質(zhì)量和效率的一個重要途徑[5]。目前我國還沒同類指導(dǎo)原則發(fā)布，且沒有基于NGS原理檢測疑似遺傳病的IVD產(chǎn)品上市。在當前情況下，通過解讀和利用FDA的該項指導(dǎo)原則希望對我國NGS產(chǎn)品注冊審評的具體研究和監(jiān)管有所啟發(fā)和借鑒。