實驗計劃法概述及其在藥學(xué)中的應(yīng)用

馬涵濤

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 洛陽 471003）

實驗計劃法（DOE）是一種以方差分析為基礎(chǔ)，利用概率論、數(shù)理統(tǒng)計和線性代數(shù)等基本統(tǒng)計理論及最少實驗次數(shù)安排（直交表），科學(xué)地安排實驗方案，正確地分析實驗結(jié)果，盡快獲得優(yōu)化方案的一種數(shù)學(xué)方法。DOE包括一系列的統(tǒng)計技術(shù)，可用于統(tǒng)計和非統(tǒng)計數(shù)據(jù)，對復(fù)雜的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計和分析，以找出變異產(chǎn)生的根源，確定每個變量的作用和變量之間的相互影響。自Fisher 1958年發(fā)明該方法以來，在農(nóng)學(xué)、工程技術(shù)等學(xué)科領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，20世紀(jì)70年代Sucker[1]和Leuenberger[2]率先將DOE應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。傳統(tǒng)的實驗操作均以標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）為基準(zhǔn)進(jìn)行，DOE使用實驗的方法來驗證標(biāo)準(zhǔn)操作中參數(shù)產(chǎn)生的合理性，通過對實驗參數(shù)進(jìn)行篩選和優(yōu)化，構(gòu)建科學(xué)、高效的實驗方法和技術(shù)路線，提高實驗效率及精確度。

1 工藝設(shè)計進(jìn)展

隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化格局的形成及信息技術(shù)的普遍應(yīng)用，在世界范圍內(nèi)有效配置資源已成為可能，企業(yè)面臨著日趨嚴(yán)峻的市場競爭。競爭的焦點從早期的降低勞動力成本，20世紀(jì)70年代的提高企業(yè)整體效率，以及20世紀(jì)80年代的全面滿足以質(zhì)量、價格、交貨期與服務(wù)等方面要求為核心的競爭，轉(zhuǎn)化為現(xiàn)在的新產(chǎn)品競爭。這是由于顧客越來越復(fù)雜多變的個性化需求，以及現(xiàn)代工業(yè)設(shè)計技術(shù)的快速發(fā)展導(dǎo)致的。工業(yè)設(shè)計是一種運(yùn)用工程技術(shù)方法，在社會、經(jīng)濟(jì)和時間等因素約束范圍內(nèi)，根據(jù)市場需求從事的產(chǎn)品設(shè)計工作。根據(jù)國際公認(rèn)的理解，工業(yè)設(shè)計是一種創(chuàng)造性行為，因此具有藝術(shù)性；而同時由于應(yīng)用了大量的以數(shù)理統(tǒng)計為基礎(chǔ)的設(shè)計控制技術(shù)，故又具有科學(xué)性。

20世紀(jì)80年代，由摩托羅拉公司首先提出了六西格瑪管理法。1999年3月，由Steve Zinkgraf博士將六西格瑪管理法運(yùn)用于設(shè)計開發(fā)領(lǐng)域，并結(jié)合設(shè)計控制技術(shù)創(chuàng)立了六西格瑪設(shè)計（DFSS）方法體系。該方法用關(guān)鍵質(zhì)量特性（CTQ）準(zhǔn)確定義與跟蹤顧客需求，并將設(shè)計控制劃分為定義（define）、測量（measure）、分析（analyze）、設(shè)計（design）與驗證（verify）5 個階段，簡稱為 DMADV。定義:選定設(shè)計項目，并進(jìn)行前期市場預(yù)研。測量:將顧客需求轉(zhuǎn)化成關(guān)鍵質(zhì)量特性，對關(guān)鍵質(zhì)量特性盡量用可測量的定量數(shù)據(jù)表達(dá)，并對系統(tǒng)設(shè)計進(jìn)行評價和控制。分析:即分析影響關(guān)鍵質(zhì)量特性和詳細(xì)設(shè)計輸出的影響因素，進(jìn)行主次排序，采用適宜的分析工具來對詳細(xì)設(shè)計階段進(jìn)行分析和評價，并進(jìn)一步建立初步實驗計劃。設(shè)計:實施詳細(xì)設(shè)計進(jìn)行具體的實驗設(shè)計以優(yōu)化參數(shù)組合，并對詳細(xì)設(shè)計結(jié)果進(jìn)行評價。驗證:進(jìn)入改進(jìn)設(shè)計階段，完成工藝設(shè)計，進(jìn)行樣機(jī)實驗及小批量實驗，對詳細(xì)設(shè)計結(jié)果進(jìn)行驗證，并最終形成量產(chǎn)，完成整個設(shè)計項目。

日本質(zhì)量管理專家田口玄一（Taguchi）博士認(rèn)為，工業(yè)產(chǎn)品70%的質(zhì)量水平是在設(shè)計階段決定的，因此可以說產(chǎn)品的質(zhì)量是設(shè)計出來的而不是制造出來的。從統(tǒng)計質(zhì)量管理的角度看，設(shè)計質(zhì)量的改進(jìn)過程就是不斷聚焦與顧客需求同步的產(chǎn)品質(zhì)量特征值，并在設(shè)計周期中盡量減少與這些質(zhì)量特征值之間差異的過程。設(shè)計質(zhì)量控制技術(shù)是達(dá)成設(shè)計質(zhì)量改進(jìn)的一組工具方法集，主要包括質(zhì)量功能展開（QFD）、失效模式與影響分析（FMEA）、故障樹分析（FTA）、田口穩(wěn)健設(shè)計方法（Taguchi）、響應(yīng)曲面模型（RSM）及調(diào)優(yōu)設(shè)計（EVOP）等。

從設(shè)計質(zhì)量控制技術(shù)特點來看，田口穩(wěn)健設(shè)計、響應(yīng)曲面模型與調(diào)優(yōu)設(shè)計都屬于實驗設(shè)計法范疇。從實驗設(shè)計的發(fā)展來看，實驗設(shè)計法主要分為兩大流派:一是西方統(tǒng)計質(zhì)量專家（以G.E.BOX為代表）提出的經(jīng)典方法，二是日本著名質(zhì)量管理專家田口玄一博士創(chuàng)立的田口方法。經(jīng)典方法采用統(tǒng)計回歸的思想擬合出質(zhì)量特性和影響因素之間的函數(shù)關(guān)系，并進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，尋找工藝參數(shù)的最佳配置，從而使輸出質(zhì)量特性最優(yōu)。經(jīng)典方法追求均值最優(yōu)，統(tǒng)計推導(dǎo)嚴(yán)謹(jǐn)，實驗階段分明，有序貫性的特點。田口方法注重實驗設(shè)計與工程技術(shù)的結(jié)合，提出穩(wěn)健設(shè)計的思想，在實驗中綜合考慮誤差因素，尋求設(shè)計參數(shù)的優(yōu)化配置，從而獲得較為穩(wěn)定的輸出質(zhì)量特性。

2 經(jīng)典實驗設(shè)計法的介紹和評估

2.1 簡介

實驗設(shè)計過程可分成實驗方案的設(shè)計和實驗結(jié)果數(shù)據(jù)分析兩部分。實驗方案的設(shè)計包括確定實驗指標(biāo)、選取因素、確定因素水平、建立實驗指標(biāo)的數(shù)學(xué)模型和設(shè)計實驗方案。實驗設(shè)計的方法類型很多，但為了提高實驗的準(zhǔn)確性和可靠性，都必須遵循3個基本原則，即隨機(jī)化原則、重復(fù)原則和局部控制原則。實驗結(jié)果數(shù)據(jù)分析是應(yīng)用線性代數(shù)、概率論和數(shù)理統(tǒng)計等數(shù)學(xué)工具對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，包括擬合模型、對模型的檢驗、實驗統(tǒng)計量的計算及對實驗經(jīng)過的解釋等。通常所說的實驗設(shè)計是指以概率論、數(shù)理統(tǒng)計和線性代數(shù)等為理論基礎(chǔ)，科學(xué)地安排實驗方案，正確地分析實驗結(jié)果，盡快獲得優(yōu)化方案的一種數(shù)學(xué)方法。

在企業(yè)研發(fā)和管理實踐中，為了開發(fā)、設(shè)計、研制新產(chǎn)品，更新或改進(jìn)老產(chǎn)品，優(yōu)化生產(chǎn)工藝方法或流程，降低原材料、動力等資源消耗，都需要深入研究質(zhì)量特性與影響因素的關(guān)系。一個標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計/生產(chǎn)過程都要受到可控因素X1，X2…Xn以及不可控因素Z1，Z2…Zm的共同作用。一般情況下，質(zhì)量特性和影響因素之間的關(guān)系式并不能根據(jù)工程知識直接建立，需要使用DOE進(jìn)行實驗與分析來找出其關(guān)系，進(jìn)一步確定設(shè)計/工藝參數(shù)的優(yōu)化組合。在設(shè)計過程中，DOE是至關(guān)重要的改善技術(shù)。

2.2 評估

2.2.1 因子設(shè)計（factorial DOE）

主要用于篩選設(shè)計，適用數(shù)學(xué)模型為線性模型。

完全要因設(shè)計（full factorial DOE，也稱為析因?qū)嶒灒?是應(yīng)用最普遍、最簡單的一種類型。假設(shè)某一實驗包括3個因素，每個因素設(shè)高、低2個水平，可將其視為一正方形，各因素水平相交于正方形的角上，該正方形即為考察區(qū)域。其他各種類型設(shè)計均是在基于此正方形的邊或面的中心增加實驗點。對于 n個因子 k水平的完全要因?qū)嶒灒Ｐ椭械闹餍?yīng)與交互效應(yīng)共計 kn－1個，模型中需要估計的參數(shù)有 kn個，因此完全要因?qū)嶒炐枰?kn次實驗。一般選擇兩水平因子實驗對主效應(yīng)與交互效應(yīng)進(jìn)行分析和評價，然后用追加中心點的方法判斷響應(yīng)擬合過程中是否存在曲率。根據(jù)效應(yīng)稀疏原理，很多系統(tǒng)在主效應(yīng)和低階的交互作用處于支配地位時，高階交互作用一般可被忽略，因此二階以上的交互作用可以不用考慮。若存在曲率，則采用響應(yīng)曲面模型進(jìn)行分析。

部分要因設(shè)計:部分要因設(shè)計源自完全要因設(shè)計[3－4]。由于設(shè)計中常常面對3個以上因子的參數(shù)優(yōu)化選擇問題，完全要因設(shè)計中盡管設(shè)定因子為兩水平，但隨著因子數(shù)的增加，實驗次數(shù)還是會以指數(shù)級增長，因此在因子數(shù)較多時，可選擇部分要因設(shè)計。將 n個2水平因子安排在2n－p次實驗中，實驗次數(shù)受 p值的調(diào)節(jié)，p＝1時是1/2部分要因?qū)嶒?，p＝2時則是1/4部分要因?qū)嶒灐来祟愅?。實驗次?shù)的降低使主因子與交互作用及交互作用間存在了混淆關(guān)系，博克斯－亨特（BOX－Hunter）進(jìn)行了分辨度設(shè)計（Design Resolution）。如分辨度Ⅲ是指主因子間沒有混淆，但主因子與兩因子交互作用以及兩因子交互作用間存在混淆關(guān)系；分辨度Ⅳ是指主因子間及主因子與兩因子交互作用沒有混淆，但兩因子交互作用間存在混淆關(guān)系；分辨度Ⅴ是指主因子間、主因子與兩因子交互作用及兩因子交互作用間均未混淆，但兩因子交互作用與三因子交互作用之間存在混淆關(guān)系。分辨度越低，實驗次數(shù)越少，混淆關(guān)系越復(fù)雜。

普通因子設(shè)計（general factorial design）:普通因子設(shè)計各因子水平數(shù)可以不同，其實驗次數(shù)為各因子水平數(shù)之積。如某試驗涉及2個因子A和B，因子A包括3個水平，因子B包括4個水平，則實驗次數(shù)為12次。通常用于所涉及因子水平數(shù)不一致的情況。

Plackett－Burman設(shè)計:1946年，Plackett和 Burman提出了Plackett－Burman設(shè)計。此設(shè)計是一種非常經(jīng)濟(jì)的設(shè)計方法，實驗次數(shù)均為4的倍數(shù)，因其分辨度較低，兩因子間交互作用嚴(yán)重混淆，主要用于只有主因子發(fā)揮作用的篩選設(shè)計，所有的交互作用均被忽略。各因子均為兩水平，設(shè)計過程中因子數(shù)為11，19，23，27，31共5種，實驗次數(shù)為 n＋1次（n為因子數(shù)）。如果實驗中所包含因子達(dá)不到上述5種規(guī)定數(shù)量，則設(shè)定一定數(shù)量啞因子（dummy factor）達(dá)到上述數(shù)量即可。

2.2.2 響應(yīng)曲面模型（RSM DOE）

在科學(xué)研究和技術(shù)實踐中線性關(guān)系僅為特例，多元關(guān)系的非線性是客觀規(guī)律的主流。RSM是對多元關(guān)系的非線性進(jìn)行優(yōu)化的實驗方法之一，于1951年由Box等[5]提出，可同時評估幾個因子的效果及其交互作用，而傳統(tǒng)的優(yōu)化方法一次僅能對一種因子進(jìn)行優(yōu)化，且難以比較幾個因子間的交互作用。響應(yīng)曲面模型分2個階段:上述的因子實驗是第一階段，用于建立一階數(shù)學(xué)模型，從而可以分析出重要影響因子與輸出的變化規(guī)律，確定最優(yōu)的因子組合；第二階段，選擇響應(yīng)曲面模型方法擬合二次回歸方程，并繪制出響應(yīng)曲面與等高線圖。

RSM只適合連續(xù)的計量值的擬合，用于考察一系列定量參數(shù)和1個或多個響應(yīng)值之間的關(guān)系，主要包括中心復(fù)合型設(shè)計（CCD）和Box－Behnken設(shè)計。CCD其實是兩水平因子設(shè)計（完全要因設(shè)計或部分要因設(shè)計）增加中心點和軸向點，其因子的水平數(shù)可達(dá)五水平，即＋α，－α，＋1，－1，0，面向中心點設(shè)計 α值為1，因此只有3個水平。其α值與因子數(shù)有關(guān)。因子可為數(shù)值因子（numeric factors）和絕對值因子（categoric factors），每增加 1 個絕對值因子或其水平增加1個實驗次數(shù)將增加1倍。CCD通常需增加3～5個中心點，用以估計實驗誤差和考察模型的準(zhǔn)確程度。增加的軸向點可以更好地評價各水平所取范圍內(nèi)的效果，使結(jié)果更具可靠性[6]。Box－Behnken設(shè)計每個因子有三水平，沒有軸向點，所有實驗點均在考察范圍之內(nèi)。與相同數(shù)量因素的CCD相比，實驗次數(shù)相對較少，因此更快捷，更經(jīng)濟(jì)。

3 DOE的步驟及數(shù)據(jù)分析

DOE通常分6步進(jìn)行:確定影響實驗結(jié)果的各種因素、水平和對實驗結(jié)果進(jìn)行評估的響應(yīng)值；選擇適宜的實驗設(shè)計方法，篩選設(shè)計或優(yōu)化設(shè)計；產(chǎn)生設(shè)計矩陣，進(jìn)行實驗；將實驗結(jié)果輸入計算機(jī)，產(chǎn)生效果圖，顯示實驗結(jié)果整體趨勢；進(jìn)行下一步實驗設(shè)計，得出最佳化值；對結(jié)果進(jìn)行驗證。

DOE涉及大量數(shù)據(jù)的產(chǎn)生與使用，手動分析DOE數(shù)據(jù)工作量，難度都非常大，必須有良好的信息管理系統(tǒng)，借助計算機(jī)信息技術(shù)對這些大量的數(shù)據(jù)進(jìn)行管理和分析，才能獲得最佳的效果。DOE軟件目前只有英文的，一般都具有 t檢驗、回歸分析、反應(yīng)曲面法（RSM）、變異數(shù)分析（ANOVA）、反應(yīng)圖表（response graphs）等功能，Design Expert是當(dāng)前使用最廣的DOE軟件，在響應(yīng)曲面和混合設(shè)計方面比JMP和MINITAB詳細(xì)完整得多，它擁有混合式設(shè)計（mixture Design），可在最短的時間發(fā)現(xiàn)最佳化的公式，用最少的成本和時間，找出影響實驗的重要因子。如實驗因子有 X，Y，Z 3項，透過實驗設(shè)計可找出系統(tǒng)的反應(yīng)。假設(shè)系統(tǒng)的反應(yīng)是f（x，y，z）＝100 X＋10 Y＋ Z，就可以忽略 Z 因子，甚至是 Y 因子，因為整個系統(tǒng)幾乎是由 X因子所操控。系統(tǒng)的反應(yīng)可以簡化成 f（x，y，z）＝100 X。因?qū)嶒灂r實際實驗的組合有限，而優(yōu)化分析的結(jié)論來自于統(tǒng)計推理，難免與實際情況有偏差，故需要進(jìn)行確認(rèn)實驗，即按所得最佳設(shè)定運(yùn)行過程，檢驗實際結(jié)果是否與預(yù)期一致。

4 DOE在制藥行業(yè)中的應(yīng)用

DOE在制藥行業(yè)中的應(yīng)用主要包括提取純化、成型工藝等因素的篩選與水平優(yōu)化、方法驗證時的穩(wěn)健性試驗。設(shè)計方法的選擇既要考慮信息需求，又要考慮實驗數(shù)量。如果僅是單一的實驗參數(shù)篩選，應(yīng)用分辨度較低的設(shè)計即可滿足要求，如完全要因設(shè)計和部分要因設(shè)計。部分要因設(shè)計較完全要因設(shè)計分辨度低，實驗次數(shù)少，所產(chǎn)生信息量也較少。分辨度為Ⅲ的部分要因設(shè)計實驗次數(shù)最少，但不能檢測各種交互作用的效果。

在工藝篩選優(yōu)化過程中，所涉及因素很多，從眾多因素中篩選出對評價指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響的主要因素，可選用完全要因設(shè)計、部分要因設(shè)計或Plackett－Burman設(shè)計法進(jìn)行設(shè)計。所有設(shè)計中各因子均為高、低2個水平，又稱雙水平篩選設(shè)計，可用較少的實驗次數(shù)篩選大量的因子。因子數(shù)為2～4個時可選完全要因設(shè)計，通常因子數(shù)目達(dá)4個以上時多選用分辨度較低、實驗次數(shù)較少的部分因子設(shè)計或Plackett－Burman設(shè)計。如楊冀艷等[7]用Plackett－Burman設(shè)計對影響荷葉總黃酮得率的因素進(jìn)行了評價，篩選出具有顯著效應(yīng)的因素，即乙醇濃度、液固比和提取次數(shù)，然后用響應(yīng)面分析法確定了主要影響因素的最佳提取條件為乙醇濃度67%、液固比34∶1（V/m），提取3次，在此條件下荷葉總黃酮得率的預(yù)測值可達(dá)3.19%，實測值為3.17%，兩者較接近。

部分因子設(shè)計時應(yīng)根據(jù)實驗需要及因子數(shù)設(shè)計適當(dāng)?shù)?p值，通常 p值的不同有時對結(jié)果無顯著影響。但因子數(shù)量一定時并不是實驗次數(shù)越少越好，在進(jìn)行實驗設(shè)計時需要考慮標(biāo)準(zhǔn)誤差，其值與自由度有關(guān)。自由度較低時，t值、ME及 SME均偏高，所得結(jié)果可能會與相同情況下自由度高時有差異。另外，實驗次數(shù)較少時，每次實驗響應(yīng)值差異明顯，變異系數(shù)較大，也會對結(jié)果產(chǎn)生一定影響[8]。

篩選出對響應(yīng)值具有顯著影響的各因子后，需要進(jìn)一步通過優(yōu)化設(shè)計找出最優(yōu)值。通常選擇響應(yīng)曲面設(shè)計中的中心復(fù)合型設(shè)計或Box－Behnken設(shè)計，找出靶向、最大化或最小化響應(yīng)值。如吳大章等[9]采用Box－Behnken設(shè)計優(yōu)化紫蘇葉揮發(fā)油－β－環(huán)糊精包合物制備工藝，得到優(yōu)化制備工藝制得紫蘇葉揮發(fā)油－β －環(huán)糊精包合物的平均包合率為（75.8±0.9）% ，收得率為（73.13 ±1.2）%，預(yù)測性良好。若同時有數(shù)個響應(yīng)值，需根據(jù)實驗要求設(shè)定每個響應(yīng)值的重要程度，得出最優(yōu)值，以滿足各響應(yīng)值的需要[10]。

5 結(jié)語

DOE發(fā)展至今已涉及多個領(lǐng)域，國外制藥工藝的篩選、優(yōu)化及驗證中也已廣泛應(yīng)用，但目前國內(nèi)報道很少。一方面，可能是因為DOE不僅需要專業(yè)知識，還需要一定的數(shù)學(xué)及統(tǒng)計學(xué)知識；另一方面，DOE是對各實驗參數(shù)一個系統(tǒng)、全面的篩選與優(yōu)化，雖然盡可能地減少了實驗次數(shù)，但在某些情況下，工作量仍然非常大。DOE有其獨特的優(yōu)勢，不僅可以節(jié)約時間和成本，而且還可大大提高參數(shù)可信度和精確度，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

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