響應(yīng)曲面優(yōu)化木瓜蛋白酶提高大豆分離蛋白乳化性的研究

張平安 ，趙秋艷，李 寧，宋蓮軍，喬明武，張建威

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)是食品體系中廣泛使用的一種蛋白質(zhì)，其功能性質(zhì)優(yōu)異，添加到食品中可以改善產(chǎn)品性能，從而廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品、烘焙制品等［1］.其乳化特性影響到相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)和開發(fā)應(yīng)用，但由于其本身乳化性能不高，達(dá)不到生產(chǎn)使用的要求，需通過各種物理、化學(xué)和生化手段對(duì)其進(jìn)行改性和修飾，從而使大豆分離蛋白的功能性質(zhì)得到顯著改善，因此，通過改性提高大豆分離蛋白的乳化性具有十分重要的意義［2］.在影響大豆蛋白乳化能力的內(nèi)在因素中，物化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)是最重要的方面［3］.其中酶法改性被人們認(rèn)為是一種較有潛力的改性方法.酶改性是利用蛋白酶的內(nèi)切作用和外切作用將蛋白分子切割成較小的分子，使蛋白的功能特性有所提高.酶法改性具有條件溫和，專一性強(qiáng)的特點(diǎn).而木瓜蛋白酶主要存在于番木瓜中、穩(wěn)定性好，對(duì)多種蛋白質(zhì)均有較好的降解作用.另外其在中國南方資源豐富，其提取和生產(chǎn)工藝比較成熟，價(jià)格低廉［4，5］.因此，本研究選擇木瓜蛋白酶針對(duì)提高大豆分離蛋白乳化性進(jìn)行研究，并用響應(yīng)曲面進(jìn)行優(yōu)化，旨在為大豆蛋白的深度開發(fā)利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

大豆分離蛋白(SPI)(哈爾濱高新科技大豆食品有限公司提供)，木瓜蛋白酶(Sigma公司50 000 U·g－1)，大豆油(市售).

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004A分析天平(上海精天電子儀器有限公司);DK－90－ⅡA水浴鍋(天津市素新特儀器有限公司);PHS－3C型pH計(jì)(上海安亭科學(xué)儀器公司);TDL－5－A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器公司);DJ1C型增力電動(dòng)攪拌器(江蘇大地自動(dòng)化儀器廠);721型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器公司).

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水解液的制備［6］大豆分離蛋白→加蒸餾水(配成一定的底物質(zhì)量濃度)→恒溫水浴中攪拌調(diào)至所需溫度及pH(6.5)→加酶(E/S)→反應(yīng)一段時(shí)間(期間維持T，pH恒定)→100℃水浴5 min 鈍化酶→離心(5 000 r·min－1，20 min)→收集上清液.

1.3.2 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定濁度法［7］將溶液倒入塑料攪拌杯中，按V(油)∶V(水)=1∶3添加90 mL溶液、30 mL油，在增力電動(dòng)攪拌器最大轉(zhuǎn)速下攪拌5 min后立即取出200 μL用0.1%的SDS稀釋到10 mL，用0.1%的 SDS作為空白，在500 nm下測(cè)定此時(shí)(0 min)的吸光值即為乳化值(EA)記做A500，10 min時(shí)仍用同樣的方法取出200 μL用0.1%的SDS稀釋到10 mL，用0.1%的 SDS作為空白，在500 nm下測(cè)定此時(shí)(10 min)的吸光值記做A'500.

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用 Design-Expert 7.1中的 Box-Behnken程序，以酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度為主要考察因子(自變量)，分別以 X1，X2，X3表示，并以+1，0，－1分別代表自變量的高、中、低水平.按方程xi=(Xi－X0)/ΔX對(duì)自變量進(jìn)行編碼.式中:xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實(shí)值，X0為試驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值，ΔX為自變量的變化步長，根據(jù)單因素試驗(yàn)選定酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度范圍.試驗(yàn)因素水平及編碼見表1.

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of response surface analysis

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2，利用 Design-Expert 7.1軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，計(jì)算大豆分離蛋白的乳化活性Y1和乳化穩(wěn)定性Y2的回歸方程并進(jìn)行方差分析.乳化活性Y1和乳化穩(wěn)定性Y2的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為:

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 7.1進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均3次重復(fù).

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大豆分離蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

由圖1可知，隨木瓜蛋白酶用量的增加，大豆分離蛋白的乳化能力及乳化穩(wěn)定性先是逐漸提高再逐漸降低，但從總體上看，乳化穩(wěn)定性的變化趨勢(shì)不大.當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，乳化活性和乳化穩(wěn)定性均達(dá)到最大值，分別為0.688和19.371.這可能是因?yàn)殡S著蛋白酶用量的增加，蛋白酶與大豆蛋白質(zhì)分子接觸概率增加，肽鏈水解程度隨之增大，線性分子數(shù)目增加，球形分子數(shù)目減少，提高了蛋白質(zhì)分子的柔韌性，使蛋白質(zhì)分子在油－水界面上的排列更加有序，乳化能力增強(qiáng).形成的蛋白質(zhì)分子薄膜具有良好的黏彈特性和抗應(yīng)變能力，乳化穩(wěn)定性提高［8］.但當(dāng)酶用量達(dá)到一定程度后，酶解程度過高，蛋白質(zhì)過高的水溶性破壞了其乳化穩(wěn)定性所需的親水親油平衡性.

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface design and results

圖1 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大豆分離蛋白乳化性影響Fig.1 The Enzyme concentration effects on emulsible of SPI

2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆分離蛋白乳化性的影響

由圖2可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行乳化活性和乳化穩(wěn)定性有變大趨勢(shì)，在1.5 h時(shí)達(dá)到最大，乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別為0.791和22.739.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)增大時(shí)，底物濃度減少，產(chǎn)物濃度增加，由于產(chǎn)物對(duì)酶的抑制作用，使酶活力下降，從而導(dǎo)致改性反應(yīng)速度降低，乳化性隨之降低.

圖2 改性時(shí)間對(duì)大豆分離蛋白乳化性的影響Fig.2 The time effecting on emulsible of SPI

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)大豆分離蛋白乳化性的影響

由圖3可知，隨反應(yīng)溫度的提高，大豆分離蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性先是逐漸提高再逐漸降低，當(dāng)改性溫度45℃時(shí)大豆分離蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性達(dá)到最大值，分別為0.587和16.281.這可能是因?yàn)槊赣凶陨淼淖钸m溫度，在這一溫度時(shí)，酶解反應(yīng)速度最大，可以使大豆分離蛋白最大限度水解從而使其側(cè)鏈的親水基朝向水相，疏水基朝向油相，使酶解后的蛋白質(zhì)分子易于定位于油—水界面，使得水和油之間的界面張力減小，乳化性增大.而超過這一溫度，酶就會(huì)變性，反應(yīng)速度減小，乳化活性和乳化穩(wěn)定性都會(huì)下降［9］.

圖3 改性溫度對(duì)大豆分離蛋白乳化性的影響Fig.3 The temperature effecting on emulsible of SPI

2.4 大豆分離蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性響應(yīng)面分析

由表3和表4的方差分析結(jié)果可以看出，兩模型 R2分別為0.867 5 和0.894 9，F(xiàn) 值分別為 3.20和3.14，P 值分別為0.042 0 和0.044 7，且失擬檢驗(yàn)不顯著，說明2模型高度顯著，即方程Y1和Y2擬合3個(gè)因素與乳化活性和乳化穩(wěn)定性之間的關(guān)系是可行的.從3因素對(duì)木瓜蛋白酶改性SPI的乳化活性的影響來看，Y1回歸方程的一次項(xiàng)A對(duì)木瓜蛋白酶改性SPI的乳化活性均有顯著影響，并且二次項(xiàng)A2，B2以及交互項(xiàng)中的AB也對(duì)乳化活性有顯著的影響，其他因素影響不顯著，這表明響應(yīng)值的變化相當(dāng)復(fù)雜，各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，而是呈二次關(guān)系，且3因素之間存在交互作用.而Y2回歸方程的一次項(xiàng)B和C對(duì)SPI的乳化穩(wěn)定性有顯著的影響，二次項(xiàng)A2，B2也對(duì)其有影響.從回歸方程的一次項(xiàng)系數(shù)可以看出3因素影響木瓜蛋白酶改性SPI的大小順序?yàn)?反應(yīng)時(shí)間＞酶濃度＞反應(yīng)溫度.

表3 乳化活性回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression equation

表4 乳化穩(wěn)定性回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance for regression equation

為了考察交互項(xiàng)對(duì)提取率的影響，在其他因素條件固定不變的情況下，考察交互項(xiàng)對(duì)提取率的影響，對(duì)模型進(jìn)行降維分析，經(jīng)Design-Expert 7.1軟件分析，所得的響應(yīng)面見圖4～5.從圖4～5中可知，在因素所考察的范圍內(nèi)乳化活性和乳化穩(wěn)定性均隨著酶濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度的變化呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)，尤其是反應(yīng)時(shí)間的影響最為明顯，這與單因素試驗(yàn)和方差分析的結(jié)論相同.

2.5 大豆分離蛋白乳化性的響應(yīng)面優(yōu)化

本試驗(yàn)的目的是乳化活性和乳化穩(wěn)定性越大越好，用 Design-Expert7.1軟件進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化，可信值為1.000的僅有1個(gè)試驗(yàn)方案，即酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.74%，反應(yīng)時(shí)間1.12 h，反應(yīng)溫度41.55 ℃，乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別為0.875和21.245.考慮到可操作性，將最優(yōu)提取條件定為酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.7%、反應(yīng)時(shí)間1.1 h、反應(yīng)溫度42℃.用此最優(yōu)提取條件進(jìn)行驗(yàn)證，得到乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別為0.869和21.025，與理論值較為接近，表明數(shù)學(xué)模型對(duì)優(yōu)化木瓜蛋白酶提高大豆分離乳化性可行.

3 結(jié)論

利用Design Expert 7.1軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，既可將復(fù)雜的試驗(yàn)次數(shù)簡化，亦可得出較佳的試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)本研究數(shù)據(jù)模型分析可知，影響因子對(duì)酶改性大豆分離蛋白的乳化性的影響依次為反應(yīng)時(shí)間＞酶濃度＞反應(yīng)溫度，通過優(yōu)化試驗(yàn)確定木瓜蛋白酶提高大豆分離蛋白乳化性的最佳酶解條件為:酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.7%，反應(yīng)時(shí)間1.1 h，反應(yīng)溫度42℃，該條件下大豆分離蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別為 0.869 和 21.025.

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