肝組織及血清中的Ang Ⅱ、TGF—β1在慢乙肝肝纖維化中的作用研究

方佩佩+潘陳為+諸葛璐+林秀珍+金玲湘

[摘要] 目的 探討肝組織及血清中AngⅡ、TGF-β1的表達(dá)與不同程度慢乙肝患者肝纖維化的關(guān)系。 方法 選取2015年1月～2016年12月在本院住院的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）1～2倍升高的慢性HBV感染患者50例，均行肝穿刺活檢術(shù)。根據(jù)Metavir評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行組織學(xué)活動(dòng)度（histologic activity，A）和纖維化分期（fibrosis，F(xiàn)）評(píng)分，將其分為輕度纖維化組（

[關(guān)鍵詞] AngⅡ；TGF-β1；肝星狀細(xì)胞；肝纖維化

[中圖分類(lèi)號(hào)] R512.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）35-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of AngII and TGF-β1 in liver tissue and serum and its relationship with chronic hepatitis B hepatic fibrosis with different degrees. Methods 50 patients with chronic HBV hospitalized in our hospital whose ALT was increased by 1-2 times from January 2016 to December 2016 were selected. Liver biopsy was performed in all patients. According to the Metavir scoring system， scores of histologic activity（A） and fibrosis staging （F） were calculated， and the patients were divided into mild fibrosis group（

[Key words] AngII； TGF-β1； Hepatic stellate cell； Liver fibrosis

眾所周知，我國(guó)是個(gè)乙肝大國(guó)，1～59歲一般人群HBsAg攜帶率為7.18%，與肝纖維化相關(guān)的肝硬化及肝細(xì)胞癌現(xiàn)已成為嚴(yán)重的社會(huì)和公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。肝纖維化是肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）增生與降解失衡，導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積的結(jié)果[2]，其中肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）使HSC激活，而HSC激活后又可分泌TGF-β1，形成TGF-β1與HSC激活之間的惡性循環(huán)[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，肝臟中存在完整的RAAS生化鏈，且與肝纖維化密切相關(guān)。當(dāng)肝臟受到各種損傷因子作用時(shí)，血管緊張素（angiotensin，Ang）Ⅱ可通過(guò)增加HSC TGF-β1的表達(dá)促進(jìn)HSC活化[5]。因此，從TGF-β1及AngⅡ信號(hào)通路研究乙肝引起的肝纖維化將是一個(gè)全新可行的方向。本研究對(duì)比分析不同程度纖維化的慢乙肝患者血清及肝臟AngⅡ、TGF-β1的水平，進(jìn)一步探討AngⅡ、TGF-β1與肝纖維化的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月～2016年12月本院住院的慢性HBV感染患者50例。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）HBsAg陽(yáng)性≥6個(gè)月；（2）HBV DNA≥105 IU/mL；（3）丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）1～2倍升高（我院ALT正常范圍9～50 U/L）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他病原體感染或藥物、酒精、免疫、中毒、遺傳代謝等其他因素所致的ALT升高；（2）合并有高血壓、糖尿病、腎功能不全或近期使用ACEI、ARB類(lèi)藥物等可能干擾RAS系統(tǒng)的患者。所有的患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 肝穿刺活檢術(shù) 50例患者均行超聲定位下肝穿刺活檢術(shù)，肝活檢組織檢查采用單人操作法，選擇16G活組織檢查穿刺針，經(jīng)B超實(shí)時(shí)定位下，經(jīng)皮快速穿刺獲取肝組織。獲取的肝組織必須在2 cm以上（至少包括3個(gè)以上匯管區(qū)）。肝臟組織病理HE染色：觀察患者肝臟炎癥活動(dòng)度和纖維化程度。根據(jù)Metavir評(píng)分系統(tǒng)中的組織學(xué)活動(dòng)度（histologic activity，A）和纖維化分期（fibrosis，F(xiàn)）標(biāo)準(zhǔn)（詳見(jiàn)2015年《慢性乙型肝炎防治指南》）[1]，將患者分為兩組，其中輕度肝纖維化組28例（mild fibrosis，MF組，Metavir評(píng)分

1.2.2 血清學(xué)檢測(cè)方法 血清TGF-β1，Ang Ⅱ采用ELISA法，HBV血清標(biāo)志HBsAg、AntiHBs、HBeAg、AntiHBe、AntiHBc檢測(cè)采用ELISA法，HBV DNA采用熒光定量PCR法，血清ALT、AST、肝纖維化4項(xiàng)指標(biāo)、AFP等測(cè)定采用自動(dòng)生化分析儀。

1.2.3 免疫組化法 觀察TGF-β1、Ang Ⅱ在患者肝組織中的分布及其關(guān)系：所有肝組織樣本均予10%甲醛固定，石蠟包埋，蠟塊連續(xù)切片3張，分別予TGF-β1及Ang Ⅱ免疫組化法染色。切片每張厚度約4 μm，免疫組化染色采用SP法，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。用已知陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液（PBS）替代一抗作為陰性對(duì)照。TGF-β1、Ang Ⅱ評(píng)分通過(guò)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行綜合評(píng)分：每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，采用半定量評(píng)分法。根據(jù)細(xì)胞的染色面積及染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評(píng)分。染色面積評(píng)分：無(wú)細(xì)胞染色為0分，<25%細(xì)胞染色為1分，25%～50%細(xì)胞染色為2分，>50%細(xì)胞染色為3分；染色強(qiáng)度：0分，無(wú)色；1分，染色弱但明顯強(qiáng)于陰性對(duì)照；2分，染色清晰，中等程度；3分，染色程度強(qiáng)。按照兩者積分相加進(jìn)行評(píng)定：0～1分為（-），1～2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++），（++～+++）定為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS14.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料與生化學(xué)檢查結(jié)果比較

50例入選患者，根據(jù)肝活檢結(jié)果分為：（1）MF組共28例，其中男18例，女10例，年齡21～38歲，平均（29.25±6.25）歲。（2）AF組共22例，其中男15例，女7例，年齡24～36歲，平均（32.5±7.5）歲。兩組間年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。肝功能、HBV DNA等結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 兩組血清肝纖維化指標(biāo)結(jié)果比較

血清肝纖維化：透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、三型前膠原這三個(gè)指標(biāo)，AF組均顯示高于MF組（P<0.05）。而四型膠原MF組與AF組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

2.3 兩組血清Ang Ⅱ及TGF-β1水平比較

MF組與AF組Ang Ⅱ水平分別為（26.2±15.60）U/L和（48.4±19.55）U/L。MF組與AF組TGF-β1水平分別為（20.55±10.62）ng/mL和（25.65±14.45）ng/mL。AF組血清Ang Ⅱ及TGF-β1顯著高于MF組（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 肝組織免疫組化學(xué)分析

Ang Ⅱ及TGF-β1陽(yáng)性為胞漿型，呈黃色或棕黃色（封三圖1）。隨著纖維化程度加深，Ang Ⅱ及TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)呈遞增趨勢(shì)。

3 討論

肝纖維化是乙肝發(fā)展為肝硬化必經(jīng)的病理過(guò)程，由于肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）增生與降解失衡，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積的結(jié)果。其中肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，其活化是肝纖維化形成的開(kāi)端[6]。HSC活化受一系列細(xì)胞信息分子和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控，作用于這些信號(hào)及其轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程或阻斷這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要環(huán)節(jié)，已成為防治肝纖維化的重要策略[7]。

長(zhǎng)期以來(lái)，肝穿刺活檢一直作為診斷肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于肝活檢是一種創(chuàng)傷性檢查，存在一定風(fēng)險(xiǎn)，且受標(biāo)本誤差的影響。盡管慢性肝炎、肝纖維化是肝臟彌漫性病變，但其病變的程度分布不均勻，1份肝活檢標(biāo)本僅占肝臟的1/100000～1/50000，難免存在樣本的誤差[8]。因此亟需發(fā)現(xiàn)可以早期協(xié)助診斷肝纖維化的指標(biāo)。有研究表明，慢乙肝患者血漿ACE的水平可作為肝纖維早期指標(biāo)[9]。

傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為：腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（Renin-angiotension-aldosterone System，RAAS）是一個(gè)循環(huán)的內(nèi)分泌系統(tǒng)。近年陸續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，肝臟中也存在完整的RAAS生化鏈，且與肝纖維化密切相關(guān)[10]。血管緊張素Ⅱ（Angiotensin，Ang Ⅱ）是RAAS系統(tǒng)的主要生物活性物質(zhì)，它需與細(xì)胞膜上的Ang受體（ATR）結(jié)合后才能發(fā)揮作用[11]。AngⅡ主要通過(guò)以下信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將上游信號(hào)傳遞至下游的應(yīng)答分子：（1）AngⅡ與AT1R結(jié)合后，使ERK和c-jun磷酸化，從而激活Ras/ERK信號(hào)通路[12]；（2）AngⅡ通過(guò)激活還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶，產(chǎn)生活性氧簇，進(jìn)一步激活Ras/ERK、PI3K/Akt 等信號(hào)通路；（3）AngⅡ還可使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH傳遞信號(hào)[13]。當(dāng)肝臟受到各種損傷因子作用時(shí)，AngⅡ除通過(guò)上述信號(hào)通路使HSC活化外，還可通過(guò)增加HSC的TGF β1表達(dá)促進(jìn)HSC激活[14]。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）作為T(mén)GF-β家族中的重要組成成員，在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，是目前公認(rèn)的最強(qiáng)的致纖維化細(xì)胞因子[15]。Akpolat等[16]運(yùn)用免疫組化方法對(duì)CHB患者肝組織中TGF-β1分布和含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)正常肝組織中TGF-β1表達(dá)量極少，但肝纖維化時(shí)可在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、纖維間隔等部位表達(dá)，并且其含量與肝纖維化程度呈正相關(guān)，這與國(guó)內(nèi)外大量相關(guān)研究結(jié)論一致。HSC激活成為肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MFB）進(jìn)而產(chǎn)生大量ECM是形成肝纖維化的中心環(huán)節(jié)[17]。TGF-β1可直接作用于HSC或通過(guò)誘導(dǎo)HSC表達(dá)血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）等細(xì)胞因子受體使HSC激活為MFB，導(dǎo)致ECM的合成和分泌能力增加，而HSC激活后又可分泌TGF-β1，形成TGF-β1與HSC激活之間的惡性循環(huán)，使ECM生成進(jìn)一步增多[18-20]。

本研究通過(guò)肝臟病理活檢顯示，Metavir評(píng)分較高者，其纖維化程度較高的，相對(duì)應(yīng)的血清及肝臟中AngⅡ、TGF-β1水平也較高。由此提示AngⅡ、TGF-β1參與了肝臟纖維化進(jìn)程。相較于肝穿刺活檢的有創(chuàng)風(fēng)險(xiǎn)及標(biāo)本誤差，檢測(cè)血清AngⅡ、TGF-β1水平則安全、快速、簡(jiǎn)便，這提示RAAS信號(hào)通路及TGF-β1有可能成為防治肝纖維化的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2017-07-14）endprint