李 歡,曹雪梅,陳 茹,賈 杰,馬桂珍,暴增海*
(1.淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院,江蘇 連云港 222005; 2.江蘇耕耘化學(xué)有限公司,江蘇 連云港 222005)
黃瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌黃瓜專化型引起的植物土傳病害[1],在露地和保護(hù)地栽培的黃瓜上均可發(fā)生,連作地區(qū)病情尤為嚴(yán)重,發(fā)病率一般為10%~30%,嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%~90%[2]。防治黃瓜枯萎病最為常見(jiàn)的方法是使用化學(xué)農(nóng)藥,包括多菌靈、菌毒清、惡霉靈、代森錳鋅等殺菌劑[3]。然而長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑不僅易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問(wèn)題,而且隨著化學(xué)藥劑的不斷使用,病菌易產(chǎn)生抗藥性。因此,尋求安全有效防治黃瓜枯萎病的方法是目前植保領(lǐng)域主要的研究方向之一。
生物防治因其安全、高效、不污染環(huán)境,在植物病害防治中顯示出良好的優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用前景,其中芽孢桿菌屬和假單胞菌屬的細(xì)菌研究較多[4]。Chung等[5]發(fā)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌ME488具有廣譜抗菌性,且能夠抑制黃瓜枯萎病的發(fā)生。李晶等[6]在黃瓜根圍土中分離得到一株枯草芽孢桿菌B29菌株,該菌株對(duì)黃瓜枯萎病的田間防效高達(dá)84.9%,且對(duì)黃瓜具有增產(chǎn)作用,增產(chǎn)效果為12.57%。苗則彥等[7]分離出一株黃瓜內(nèi)生枯草芽孢桿菌B504菌株,該菌株對(duì)黃瓜枯萎病菌的生長(zhǎng)抑制率達(dá)44.1%。王燦華等[8]從植物根際土壤中分離出一株假單胞菌M18菌株,該菌株與植物根系存在互利共生關(guān)系,可大量生存在植物根際周圍,形成一種生物屏障,從而抑制土傳病原菌的生長(zhǎng)并阻止病原菌侵入植物體內(nèi);以M18活菌浸種處理黃瓜種子并在大棚定植后灌根處理黃瓜幼苗,可使黃瓜枯萎病的發(fā)病率降低70%~80%,并使黃瓜產(chǎn)量提高20%。
多黏類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)作為生防菌的一個(gè)重要組分,對(duì)小麥赤霉病[9]、番茄青枯病[10]、木麻黃青枯病[11]等多種植物病害均有一定的防治效果。曹利亞等[12]還發(fā)現(xiàn),多黏類芽孢桿菌HT16對(duì)梨黑斑病菌有較強(qiáng)的抑制作用,其體外抑制率為53.2%,能顯著抑制梨采后黑斑病的發(fā)生。由華東理工大學(xué)與上海澤元海洋生物技術(shù)有限公司聯(lián)合創(chuàng)制的多黏類芽孢桿菌可濕性粉劑(登記證號(hào):PD20140273)對(duì)番茄青枯病、西瓜枯萎病、黃瓜角斑病和西瓜炭疽病都有明顯的防治作用,已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用[13]。
海洋多黏類芽孢桿菌具有耐鹽和產(chǎn)生不同于陸源微生物代謝產(chǎn)物的特點(diǎn),可以作為鹽堿地防治土傳病害生物農(nóng)藥的最佳選擇。馬桂珍等[14]從連云港海域海泥中分離得到1株多黏類芽孢桿菌L1-9菌株,該菌株對(duì)多種植物病原真菌和細(xì)菌有較好的抑制作用,并且能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶和纖維素酶等細(xì)胞壁水解酶和抗菌蛋白[15],具有一定的開(kāi)發(fā)潛力。本試驗(yàn)以L1-9菌株粉劑為研究對(duì)象,測(cè)定其對(duì)黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumsp.cucumebriumOwen)、大豆菌核病菌(Sclerotinasclerotiorum)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)、菠菜早疫病菌(Alternariasolani)4種植物病原真菌的毒力,并探討其對(duì)黃瓜枯萎病的防治作用和對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的促進(jìn)作用,為海洋多黏類芽孢桿菌菌劑的研究提供參考依據(jù),也為生物農(nóng)藥的研發(fā)增加一個(gè)新的素材。
1.1.1 供試粉劑 多黏類芽孢桿菌L1-9菌株粉劑自制,含菌量為2.4×1010cfu/g。
1.1.2 植物病原菌 黃瓜枯萎病菌、大豆菌核病菌、水稻紋枯病菌、菠菜早疫病菌由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)所提供。
1.1.3 培養(yǎng)基 病原真菌活化及抑菌試驗(yàn)用培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基;黃瓜枯萎病菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基為麥粒砂培養(yǎng)基:麥粒40 g、水60 mL、砂100 g,pH值自然。
1.1.4 黃瓜種子 品種為金盛達(dá)四號(hào),由南京金盛達(dá)種子有限公司生產(chǎn),購(gòu)于連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子中心。
1.1.5 土壤 供試土壤為連云港市東辛農(nóng)場(chǎng)菜園土,取回除雜后121 ℃高壓蒸汽滅菌2 h,備用。
1.2.1 海洋細(xì)菌L1-9菌株粉劑對(duì)4種植物病原真菌的毒力測(cè)定 采用含藥平板法,將不同質(zhì)量的L1-9菌株菌劑加入到裝有70 mL PDA培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中,混合均勻,制成濃度不同的含藥平板,每個(gè)三角瓶為一個(gè)濃度,平均倒入3個(gè)培養(yǎng)皿中,為3個(gè)重復(fù),以不加粉劑為對(duì)照。取直徑為5 mm的供試黃瓜枯萎病菌、大豆菌核病菌、水稻紋枯病菌、菠菜早疫病菌4種植物病原真菌菌苔于不同濃度的含藥平板中央,28 ℃下培養(yǎng)5 d。采用十字交叉法測(cè)量植物病原真菌菌落直徑,計(jì)算抑制率,查詢抑制率概率值,以粉劑質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),抑制率的概率值為縱坐標(biāo),建立L1-9菌株粉劑對(duì)4種植物病原真菌的毒力回歸方程,計(jì)算半數(shù)有效質(zhì)量濃度(EC50)和90%有效質(zhì)量濃度(EC90)。
1.2.2 不同用藥方法對(duì)黃瓜幼苗的促生防病效果測(cè)定 將直徑9 mm的黃瓜枯萎病菌菌苔接種到黃瓜枯萎病菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基中,28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。取出擴(kuò)繁后的黃瓜枯萎病菌培養(yǎng)物加入土壤中,混勻制成菌含量為3%的含菌土壤。
設(shè)拌種法、拌土法、灌根法3種施藥方法。拌種法:取黃瓜種子質(zhì)量3%的菌株粉劑對(duì)黃瓜種子進(jìn)行拌種后催芽,接種到已制備好的含菌土壤中;拌土法:制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的含藥土壤,將已催芽的黃瓜種子接種到制備好的黃瓜枯萎病菌土壤中,在黃瓜種子上下各鋪一層含藥土壤;灌根法:將催芽后的黃瓜種子播種在裝有黃瓜枯萎病菌土壤的塑料杯中,待黃瓜長(zhǎng)到子葉期時(shí),用20%的菌株粉劑溶液進(jìn)行灌根處理。每個(gè)方法處理10盆,每盆3株,播種后正常管理,不施用農(nóng)藥和化肥,以不施用菌株粉劑的黃瓜為對(duì)照(CK)。
黃瓜幼苗生長(zhǎng)至三葉期時(shí),測(cè)定幼苗的株高、莖粗、地上和地下部鮮質(zhì)量以及須根數(shù),調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù),計(jì)算防病效果。
分別將0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、4 g的L1-9菌株粉劑加入到裝有70 mL PDA的三角瓶中,混合均勻,制成不同濃度的含藥平板,用于測(cè)定L1-9菌株粉劑對(duì)大豆菌核病菌的毒力;分別將0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2 g的L1-9菌株粉劑加入到裝有70 mL PDA的三角瓶中,混合均勻,制成不同濃度的含藥平板,用于測(cè)定L1-9菌株粉劑對(duì)黃瓜枯萎病菌、水稻紋枯病菌、菠菜早疫病菌的毒力。L1-9菌株粉劑對(duì)4種植物病原菌的毒力回歸方程見(jiàn)表1。
表1 L1-9菌株粉劑對(duì)4種病原真菌的毒力測(cè)定結(jié)果
從表1可以看出,L1-9菌株粉劑對(duì)4種病原真菌生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用,其對(duì)4種病原真菌的EC50大小順序?yàn)椋捍蠖咕瞬【?53.689 5 mg/L)>水稻紋枯病菌(50.811 3 mg/L)>黃瓜枯萎病菌(48.925 2 mg/L)>菠菜早疫病菌(38.312 2 mg/L)。L1-9菌株粉劑對(duì)4種病原真菌的EC90大小順序同樣為:大豆菌核病菌(95.893 5 mg/L)>水稻紋枯病菌(90.231 3 mg/L)>黃瓜枯萎病菌(86.713 2 mg/L)>菠菜早疫病菌(66.732 2 mg/L)。結(jié)果表明,L1-9菌株粉劑對(duì)菠菜早疫病菌的抑制作用最強(qiáng),對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制作用次之,對(duì)大豆菌核病菌、水稻紋枯病菌的抑制作用較差。
從表2可以看出,采用3種不同的用藥方法,L1-9菌株粉劑對(duì)黃瓜生長(zhǎng)均具有明顯的促進(jìn)作用。不同用藥方法處理后,黃瓜地上部分鮮質(zhì)量的增加最為明顯,其中采用拌土法處理的黃瓜幼苗地上部分鮮質(zhì)量增加最多,比CK增加了243.75%,采用拌種法處理后地上部分鮮質(zhì)量比CK增加了215.79%,灌根處理后地上部分鮮質(zhì)量增加了184.09%。3種用藥方法處理后黃瓜幼苗地下部分鮮質(zhì)量的增加量也都超過(guò)了50%。拌種和拌土處理后黃瓜幼苗的須根數(shù)分別增加了113.11%和101.61%,灌根處理后的須根數(shù)也增加了81.67%,但灌根用藥對(duì)黃瓜的株高和莖粗沒(méi)有促進(jìn)作用。
從表3可以看出,L1-9菌株粉劑不同用藥方法對(duì)黃瓜枯萎病均具有較強(qiáng)的防治作用。未用菌株粉劑處理的黃瓜發(fā)病率均為70%以上,病情指數(shù)也達(dá)到45以上,用L1-9菌株粉劑處理后黃瓜發(fā)病率降低到35%以下,病情指數(shù)也降低到10左右。3種用藥方法對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果均在75%以上,其中拌土處理的防治效果最高,為81.32%,其次為灌根處理,防治效果為78.75%,拌種處理的防治效果也達(dá)到了77.12%。結(jié)果表明,L1-9菌株粉劑對(duì)黃瓜枯萎病具有明顯的防治作用,其最適的用藥方法為拌土法。
表2 L1-9菌株粉劑不同用藥方法對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的影響
表3 L1-9菌株粉劑不同用藥方法對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果
L1-9菌株粉劑對(duì)4種植物病原菌的毒力測(cè)定結(jié)果表明,其對(duì)黃瓜枯萎病菌、大豆菌核病菌、水稻紋枯病菌、菠菜早疫病菌均有一定的抑制作用。王希等[16]對(duì)L1-9菌株發(fā)酵液的研究顯示,其對(duì)黃瓜的防病效果為64.71%,而本試驗(yàn)中L1-9菌株粉劑的防病效果在75%以上,較發(fā)酵液的防病效果明顯增加,推測(cè)可能與用藥方式和菌含量的不同有關(guān)。這為其開(kāi)發(fā)利用提供了參考依據(jù)。
近年來(lái),有關(guān)防治植物病害的微生物制劑的研究報(bào)道日益增加??灯贾サ萚17]研究的哈茨木霉制劑對(duì)設(shè)施連作番茄枯萎病的防治效果在75%以上,且對(duì)番茄的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用,能夠明顯改善番茄根際土壤微生態(tài)環(huán)境。何斐等[18]研究的生防鏈孢霉菌Act11和Act12菌劑對(duì)魔芋軟腐病有良好的防病作用,其相對(duì)防效在65%以上。秦娟娟等[19]研究了植物內(nèi)生細(xì)菌固體菌劑對(duì)辣椒的促生防病作用,其中對(duì)辣椒疫霉病的防治效果為75.0%~84.2%,與本試驗(yàn)中L1-9菌株粉劑對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果相當(dāng)。
微生物制劑配合施用的研究也日益增多[20]。甘良等[21]、張忠良等[22]、申光輝等[23]分別研究了放線菌混合制劑對(duì)西瓜的防病促生作用、放線菌與有機(jī)鉀肥腐植酸鉀配施對(duì)魔芋的防病促生作用、密旋鏈霉菌與硅酸鉀配施對(duì)草莓的防病促生作用,結(jié)果顯示,放線菌混合制劑施用對(duì)植株的防病效果和放線菌與鉀肥的配合施用對(duì)植株的防病效果都優(yōu)于單獨(dú)菌株,能夠更好地發(fā)揮其生防效果。李廣記等[24]通過(guò)研究木霉菌菌劑、枯草芽孢桿菌菌劑和混合菌劑對(duì)水稻紋枯病病情指數(shù)的影響,發(fā)現(xiàn)單一微生物菌劑的處理效果優(yōu)于混合菌劑處理。這2種不同結(jié)果可能與試驗(yàn)菌劑不同有關(guān)。本研究中,防治黃瓜枯萎病所采用的L1-9菌株粉劑為單一微生物制劑,其與其他菌劑或肥料配合施用是否具有增效作用有待進(jìn)一步研究。
微生物制劑的使用方法不同,其防治效果也會(huì)有所不同。李廣記等[24]探討了不同菌劑的最適用藥方式,發(fā)現(xiàn)菌劑不同,其最適的用藥方式也不同。木霉菌菌劑適合拌土使用,枯草芽孢桿菌菌劑適合多種用藥方法聯(lián)合使用,混合菌劑適合拌土+蘸根聯(lián)合使用。本試驗(yàn)也研究了L1-9菌株粉劑不同用藥方法對(duì)黃瓜的促生防病效果,結(jié)果同樣顯示,用藥方式不同,促生防病效果有所差別,L1-9菌株粉劑最適的用藥方法為拌土法。
此次防病研究采用的是室內(nèi)盆栽試驗(yàn),然而將菌劑大規(guī)模應(yīng)用于田間時(shí),防病效果會(huì)受到土壤、降雨量、溫濕度等因素的影響[25],因此,L1-9菌株粉劑的大田防效及其穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步研究。
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