海洋多黏類芽孢桿菌L1-9菌株粉劑對(duì)黃瓜的促生防病作用

李 歡,曹雪梅,陳 茹,賈 杰,馬桂珍,暴增海*

(1.淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院，江蘇 連云港 222005； 2.江蘇耕耘化學(xué)有限公司，江蘇 連云港 222005)

黃瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌黃瓜專化型引起的植物土傳病害[1]，在露地和保護(hù)地栽培的黃瓜上均可發(fā)生，連作地區(qū)病情尤為嚴(yán)重，發(fā)病率一般為10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%～90%[2]。防治黃瓜枯萎病最為常見(jiàn)的方法是使用化學(xué)農(nóng)藥，包括多菌靈、菌毒清、惡霉靈、代森錳鋅等殺菌劑[3]。然而長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑不僅易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問(wèn)題，而且隨著化學(xué)藥劑的不斷使用，病菌易產(chǎn)生抗藥性。因此，尋求安全有效防治黃瓜枯萎病的方法是目前植保領(lǐng)域主要的研究方向之一。

生物防治因其安全、高效、不污染環(huán)境，在植物病害防治中顯示出良好的優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用前景，其中芽孢桿菌屬和假單胞菌屬的細(xì)菌研究較多[4]。Chung等[5]發(fā)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌ME488具有廣譜抗菌性，且能夠抑制黃瓜枯萎病的發(fā)生。李晶等[6]在黃瓜根圍土中分離得到一株枯草芽孢桿菌B29菌株，該菌株對(duì)黃瓜枯萎病的田間防效高達(dá)84.9%，且對(duì)黃瓜具有增產(chǎn)作用，增產(chǎn)效果為12.57%。苗則彥等[7]分離出一株黃瓜內(nèi)生枯草芽孢桿菌B504菌株，該菌株對(duì)黃瓜枯萎病菌的生長(zhǎng)抑制率達(dá)44.1%。王燦華等[8]從植物根際土壤中分離出一株假單胞菌M18菌株，該菌株與植物根系存在互利共生關(guān)系，可大量生存在植物根際周圍，形成一種生物屏障，從而抑制土傳病原菌的生長(zhǎng)并阻止病原菌侵入植物體內(nèi)；以M18活菌浸種處理黃瓜種子并在大棚定植后灌根處理黃瓜幼苗，可使黃瓜枯萎病的發(fā)病率降低70%～80%，并使黃瓜產(chǎn)量提高20%。

多黏類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)作為生防菌的一個(gè)重要組分，對(duì)小麥赤霉病[9]、番茄青枯病[10]、木麻黃青枯病[11]等多種植物病害均有一定的防治效果。曹利亞等[12]還發(fā)現(xiàn)，多黏類芽孢桿菌HT16對(duì)梨黑斑病菌有較強(qiáng)的抑制作用，其體外抑制率為53.2%，能顯著抑制梨采后黑斑病的發(fā)生。由華東理工大學(xué)與上海澤元海洋生物技術(shù)有限公司聯(lián)合創(chuàng)制的多黏類芽孢桿菌可濕性粉劑(登記證號(hào)：PD20140273)對(duì)番茄青枯病、西瓜枯萎病、黃瓜角斑病和西瓜炭疽病都有明顯的防治作用，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用[13]。

海洋多黏類芽孢桿菌具有耐鹽和產(chǎn)生不同于陸源微生物代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)，可以作為鹽堿地防治土傳病害生物農(nóng)藥的最佳選擇。馬桂珍等[14]從連云港海域海泥中分離得到1株多黏類芽孢桿菌L1-9菌株，該菌株對(duì)多種植物病原真菌和細(xì)菌有較好的抑制作用，并且能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶和纖維素酶等細(xì)胞壁水解酶和抗菌蛋白[15]，具有一定的開(kāi)發(fā)潛力。本試驗(yàn)以L1-9菌株粉劑為研究對(duì)象，測(cè)定其對(duì)黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumsp.cucumebriumOwen)、大豆菌核病菌(Sclerotinasclerotiorum)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)、菠菜早疫病菌(Alternariasolani)4種植物病原真菌的毒力，并探討其對(duì)黃瓜枯萎病的防治作用和對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，為海洋多黏類芽孢桿菌菌劑的研究提供參考依據(jù)，也為生物農(nóng)藥的研發(fā)增加一個(gè)新的素材。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試粉劑 多黏類芽孢桿菌L1-9菌株粉劑自制，含菌量為2.4×1010cfu/g。

1.1.2 植物病原菌 黃瓜枯萎病菌、大豆菌核病菌、水稻紋枯病菌、菠菜早疫病菌由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)所提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 病原真菌活化及抑菌試驗(yàn)用培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基；黃瓜枯萎病菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基為麥粒砂培養(yǎng)基：麥粒40 g、水60 mL、砂100 g，pH值自然。

1.1.4 黃瓜種子 品種為金盛達(dá)四號(hào)，由南京金盛達(dá)種子有限公司生產(chǎn)，購(gòu)于連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子中心。

1.1.5 土壤 供試土壤為連云港市東辛農(nóng)場(chǎng)菜園土，取回除雜后121 ℃高壓蒸汽滅菌2 h，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 海洋細(xì)菌L1-9菌株粉劑對(duì)4種植物病原真菌的毒力測(cè)定 采用含藥平板法，將不同質(zhì)量的L1-9菌株菌劑加入到裝有70 mL PDA培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，混合均勻，制成濃度不同的含藥平板，每個(gè)三角瓶為一個(gè)濃度，平均倒入3個(gè)培養(yǎng)皿中，為3個(gè)重復(fù)，以不加粉劑為對(duì)照。取直徑為5 mm的供試黃瓜枯萎病菌、大豆菌核病菌、水稻紋枯病菌、菠菜早疫病菌4種植物病原真菌菌苔于不同濃度的含藥平板中央，28 ℃下培養(yǎng)5 d。采用十字交叉法測(cè)量植物病原真菌菌落直徑，計(jì)算抑制率，查詢抑制率概率值，以粉劑質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率的概率值為縱坐標(biāo)，建立L1-9菌株粉劑對(duì)4種植物病原真菌的毒力回歸方程，計(jì)算半數(shù)有效質(zhì)量濃度(EC50)和90%有效質(zhì)量濃度(EC90)。

1.2.2 不同用藥方法對(duì)黃瓜幼苗的促生防病效果測(cè)定 將直徑9 mm的黃瓜枯萎病菌菌苔接種到黃瓜枯萎病菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。取出擴(kuò)繁后的黃瓜枯萎病菌培養(yǎng)物加入土壤中，混勻制成菌含量為3%的含菌土壤。

設(shè)拌種法、拌土法、灌根法3種施藥方法。拌種法：取黃瓜種子質(zhì)量3%的菌株粉劑對(duì)黃瓜種子進(jìn)行拌種后催芽，接種到已制備好的含菌土壤中；拌土法：制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的含藥土壤，將已催芽的黃瓜種子接種到制備好的黃瓜枯萎病菌土壤中，在黃瓜種子上下各鋪一層含藥土壤；灌根法：將催芽后的黃瓜種子播種在裝有黃瓜枯萎病菌土壤的塑料杯中，待黃瓜長(zhǎng)到子葉期時(shí)，用20%的菌株粉劑溶液進(jìn)行灌根處理。每個(gè)方法處理10盆，每盆3株，播種后正常管理，不施用農(nóng)藥和化肥，以不施用菌株粉劑的黃瓜為對(duì)照(CK)。

黃瓜幼苗生長(zhǎng)至三葉期時(shí)，測(cè)定幼苗的株高、莖粗、地上和地下部鮮質(zhì)量以及須根數(shù)，調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)，計(jì)算防病效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 L1-9菌株粉劑對(duì)4種病原真菌的毒力

分別將0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、4 g的L1-9菌株粉劑加入到裝有70 mL PDA的三角瓶中，混合均勻，制成不同濃度的含藥平板，用于測(cè)定L1-9菌株粉劑對(duì)大豆菌核病菌的毒力；分別將0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2 g的L1-9菌株粉劑加入到裝有70 mL PDA的三角瓶中，混合均勻，制成不同濃度的含藥平板，用于測(cè)定L1-9菌株粉劑對(duì)黃瓜枯萎病菌、水稻紋枯病菌、菠菜早疫病菌的毒力。L1-9菌株粉劑對(duì)4種植物病原菌的毒力回歸方程見(jiàn)表1。

表1 L1-9菌株粉劑對(duì)4種病原真菌的毒力測(cè)定結(jié)果

從表1可以看出，L1-9菌株粉劑對(duì)4種病原真菌生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用，其對(duì)4種病原真菌的EC50大小順序?yàn)椋捍蠖咕瞬【?53.689 5 mg/L)>水稻紋枯病菌(50.811 3 mg/L)>黃瓜枯萎病菌(48.925 2 mg/L)>菠菜早疫病菌(38.312 2 mg/L)。L1-9菌株粉劑對(duì)4種病原真菌的EC90大小順序同樣為：大豆菌核病菌(95.893 5 mg/L)>水稻紋枯病菌(90.231 3 mg/L)>黃瓜枯萎病菌(86.713 2 mg/L)>菠菜早疫病菌(66.732 2 mg/L)。結(jié)果表明，L1-9菌株粉劑對(duì)菠菜早疫病菌的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制作用次之，對(duì)大豆菌核病菌、水稻紋枯病菌的抑制作用較差。

2.2 L1-9菌株粉劑對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的促進(jìn)作用

從表2可以看出，采用3種不同的用藥方法，L1-9菌株粉劑對(duì)黃瓜生長(zhǎng)均具有明顯的促進(jìn)作用。不同用藥方法處理后，黃瓜地上部分鮮質(zhì)量的增加最為明顯，其中采用拌土法處理的黃瓜幼苗地上部分鮮質(zhì)量增加最多，比CK增加了243.75%，采用拌種法處理后地上部分鮮質(zhì)量比CK增加了215.79%，灌根處理后地上部分鮮質(zhì)量增加了184.09%。3種用藥方法處理后黃瓜幼苗地下部分鮮質(zhì)量的增加量也都超過(guò)了50%。拌種和拌土處理后黃瓜幼苗的須根數(shù)分別增加了113.11%和101.61%，灌根處理后的須根數(shù)也增加了81.67%，但灌根用藥對(duì)黃瓜的株高和莖粗沒(méi)有促進(jìn)作用。

2.3 L1-9菌株粉劑對(duì)黃瓜枯萎病的防治作用

從表3可以看出，L1-9菌株粉劑不同用藥方法對(duì)黃瓜枯萎病均具有較強(qiáng)的防治作用。未用菌株粉劑處理的黃瓜發(fā)病率均為70%以上，病情指數(shù)也達(dá)到45以上，用L1-9菌株粉劑處理后黃瓜發(fā)病率降低到35%以下，病情指數(shù)也降低到10左右。3種用藥方法對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果均在75%以上，其中拌土處理的防治效果最高，為81.32%，其次為灌根處理，防治效果為78.75%，拌種處理的防治效果也達(dá)到了77.12%。結(jié)果表明，L1-9菌株粉劑對(duì)黃瓜枯萎病具有明顯的防治作用，其最適的用藥方法為拌土法。

表2 L1-9菌株粉劑不同用藥方法對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的影響

表3 L1-9菌株粉劑不同用藥方法對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果

3 結(jié)論與討論

L1-9菌株粉劑對(duì)4種植物病原菌的毒力測(cè)定結(jié)果表明，其對(duì)黃瓜枯萎病菌、大豆菌核病菌、水稻紋枯病菌、菠菜早疫病菌均有一定的抑制作用。王希等[16]對(duì)L1-9菌株發(fā)酵液的研究顯示，其對(duì)黃瓜的防病效果為64.71%，而本試驗(yàn)中L1-9菌株粉劑的防病效果在75%以上，較發(fā)酵液的防病效果明顯增加，推測(cè)可能與用藥方式和菌含量的不同有關(guān)。這為其開(kāi)發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

近年來(lái)，有關(guān)防治植物病害的微生物制劑的研究報(bào)道日益增加?？灯贾サ萚17]研究的哈茨木霉制劑對(duì)設(shè)施連作番茄枯萎病的防治效果在75%以上，且對(duì)番茄的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，能夠明顯改善番茄根際土壤微生態(tài)環(huán)境。何斐等[18]研究的生防鏈孢霉菌Act11和Act12菌劑對(duì)魔芋軟腐病有良好的防病作用，其相對(duì)防效在65%以上。秦娟娟等[19]研究了植物內(nèi)生細(xì)菌固體菌劑對(duì)辣椒的促生防病作用，其中對(duì)辣椒疫霉病的防治效果為75.0%～84.2%，與本試驗(yàn)中L1-9菌株粉劑對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果相當(dāng)。

微生物制劑配合施用的研究也日益增多[20]。甘良等[21]、張忠良等[22]、申光輝等[23]分別研究了放線菌混合制劑對(duì)西瓜的防病促生作用、放線菌與有機(jī)鉀肥腐植酸鉀配施對(duì)魔芋的防病促生作用、密旋鏈霉菌與硅酸鉀配施對(duì)草莓的防病促生作用，結(jié)果顯示，放線菌混合制劑施用對(duì)植株的防病效果和放線菌與鉀肥的配合施用對(duì)植株的防病效果都優(yōu)于單獨(dú)菌株，能夠更好地發(fā)揮其生防效果。李廣記等[24]通過(guò)研究木霉菌菌劑、枯草芽孢桿菌菌劑和混合菌劑對(duì)水稻紋枯病病情指數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)單一微生物菌劑的處理效果優(yōu)于混合菌劑處理。這2種不同結(jié)果可能與試驗(yàn)菌劑不同有關(guān)。本研究中，防治黃瓜枯萎病所采用的L1-9菌株粉劑為單一微生物制劑，其與其他菌劑或肥料配合施用是否具有增效作用有待進(jìn)一步研究。

微生物制劑的使用方法不同，其防治效果也會(huì)有所不同。李廣記等[24]探討了不同菌劑的最適用藥方式，發(fā)現(xiàn)菌劑不同，其最適的用藥方式也不同。木霉菌菌劑適合拌土使用，枯草芽孢桿菌菌劑適合多種用藥方法聯(lián)合使用，混合菌劑適合拌土+蘸根聯(lián)合使用。本試驗(yàn)也研究了L1-9菌株粉劑不同用藥方法對(duì)黃瓜的促生防病效果，結(jié)果同樣顯示，用藥方式不同，促生防病效果有所差別，L1-9菌株粉劑最適的用藥方法為拌土法。

此次防病研究采用的是室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，然而將菌劑大規(guī)模應(yīng)用于田間時(shí)，防病效果會(huì)受到土壤、降雨量、溫濕度等因素的影響[25]，因此，L1-9菌株粉劑的大田防效及其穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步研究。

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