牡荊素對(duì)異氟烷誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

陳琳琳　王艷生　齊英凱

(滄州市中心醫(yī)院麻醉科，河北　滄州　061001)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)是常出現(xiàn)在手術(shù)麻醉后患者中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，在老年患者中尤為常見，其表現(xiàn)為內(nèi)心焦慮、精神錯(cuò)亂、記憶受損或短時(shí)間性格改變等〔1〕。POCD常導(dǎo)致患者的康復(fù)延遲、病死率增加，嚴(yán)重者甚至發(fā)展為阿爾茨海默病〔2〕。異氟烷(IF)是臨床上常用的揮發(fā)性吸入麻醉藥，其誘導(dǎo)和蘇醒過(guò)程迅速、平穩(wěn)，麻醉效力強(qiáng)，且對(duì)循環(huán)肝腎功能影響小〔3〕。而麻醉藥物的細(xì)胞毒性和中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制作用，被認(rèn)為是導(dǎo)致POCD發(fā)生的主要原因〔4〕。研究顯示POCD可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)有關(guān)，如促炎因子的過(guò)度釋放是 IF誘導(dǎo)老年大鼠認(rèn)知損傷的一個(gè)重要機(jī)制〔5〕。牡荊素(VT)又名牡荊苷，是從牡荊葉、牡荊子及山楂葉中提取的黃酮碳苷類有效單體成分，牡荊苷具有抗心肌梗死、抗炎鎮(zhèn)痛、抗感染、降血壓、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗記憶損傷和神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用等多種藥理作用〔6，7〕。本研究旨在探討VT對(duì)IF誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制。

1　材料及方法

1.1試劑及儀器IF(Baxter，USA)，VT(固體粉劑，純度：99.8%，批號(hào)：2015034，西安昊軒生物科技)，MTT細(xì)胞生長(zhǎng)增殖/毒性檢測(cè)試劑盒(Sigma，USA)，兔抗人NSE單抗(CST，USA)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(博士德公司，武漢)，免疫組化檢測(cè)試劑盒(福州邁新生物科技)，β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42,腫瘤壞死因子(TNF)-α和干擾素(INF)-γ的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒(Sigma，USA)，Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基生物，江蘇)，奧林巴斯熒光倒置顯微鏡Olympus IX7(Olympus，日本，UIS2光學(xué)成像系統(tǒng)，Image-Pro Plus7.0成像系統(tǒng))，Multiskan MK 3酶標(biāo)儀(Thermo，USA，型號(hào)413MBY042078)，F(xiàn)ACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))，Ste-phan ARTEC-C麻醉機(jī)(Drager，Ger)。

1.2海馬神經(jīng)細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng)雄性新生SD大鼠1只(出生24 h內(nèi)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2016-0011)。將SD大鼠脊椎脫臼法處死，斷頭后用75%的酒精消毒，剪開腦部的皮膚后分離出顱骨，使雙側(cè)大腦暴露后，分離出雙側(cè)的大腦半球，立即轉(zhuǎn)移至含D-Hank液的培養(yǎng)皿中，小心分離皮層并取出海馬組織，D-Hank液中漂洗3次后分離血絲和腦膜，得海馬組織，將其用眼科剪剪成1.0 mm3小塊，胰酶消化25 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，800 r/min離心10 min，棄培養(yǎng)基，用吸管緩慢吹打混勻，靜置5 min，上清液即為海馬神經(jīng)細(xì)胞懸液，以4×105/ml的細(xì)胞密度接種到6 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種24 h將培養(yǎng)液全量換成無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液，第48小時(shí)后加入10 μmol/L阿糖胞苷抑制非神經(jīng)元細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)，隨后每3 d半量換液一次。顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)，并采用免疫組化NSE染色鑒定。該實(shí)驗(yàn)的研究方案經(jīng)我醫(yī)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)。

1.3細(xì)胞及動(dòng)物給藥處理體外實(shí)驗(yàn)：按1.2的操作成功分離原代新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)于涂有多聚賴氨酸的35 mm培養(yǎng)皿中，調(diào)整細(xì)胞終濃度為106個(gè)/ml。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，2% IF組(IF)，2% IF+30 mg/L VT(IF+30 VT)組，2% IF+50 mg/L VT(IF+50 VT)組，2% IF+100 mg/L VT(IF+100 VT)組。2% IF由Ste-phan ARTEC-C麻醉機(jī)提供，載氣為空氣+5%CO2，空白對(duì)照組不經(jīng) IF處理，于恒溫孵育箱內(nèi)正常培養(yǎng)，其余各組均在不同濃度的VT處理前暴露于2% IF中6 h。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：20月齡、體重(500±50)g的雄性SD大鼠共15只，實(shí)驗(yàn)大鼠分五組，每組3只，包括對(duì)照組、IF、IF+30 VT、IF+50 VT和IF+100 VT組。對(duì)照組不吸入IF，于恒溫動(dòng)物房?jī)?nèi)正常培養(yǎng)，其余各組均在不同濃度的VT處理前置于麻醉誘導(dǎo)箱內(nèi)統(tǒng)一吸入一次2%的 IF與O2(2 L/min)的混合氣體，時(shí)間為2 h。隨后在吸入 IF的第1～5天連續(xù)腹腔注射30、50、100 mg/kg的VT，每天1次。其中對(duì)照組注射等量生理鹽水溶液，不同濃度VT組則使用生理鹽水溶解。

1.4免疫組化NSE染色鑒定海馬神經(jīng)細(xì)胞取培養(yǎng)至第8 d的細(xì)胞，將細(xì)胞直接鋪在12孔板上，用4%多聚甲醛固定后，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，4%的多聚甲醛固定30 min，過(guò)氧化氫消除過(guò)氧化氫酶5 min，室溫下山羊血清封閉15 min，吸除多余液體后加NSE一抗(1∶1 000)孵育，4℃過(guò)夜，PBS清洗3次后室溫孵育辣根酶標(biāo)記的二抗10 min，PBS清洗3次，采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，經(jīng)蘇木素復(fù)染10 s后1%的HCl-C2H5OH分化，迅速用自來(lái)水沖洗，后經(jīng)酒精脫水和二甲苯透明后，用中性樹膠封片，顯微鏡下采集200倍的圖像，NSE蛋白陽(yáng)性表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)為神經(jīng)元胞質(zhì)及部分突起著色為棕黃色。

1.5MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)分組及處理方式見1.3，取培養(yǎng)至第8天經(jīng)NSE免疫組化鑒定的海馬神經(jīng)細(xì)胞，以3×104個(gè)/ml的密度接種于96孔板中，每孔200 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，將IF、IF+30 VT、IF+50 VT和IF+100 VT組分別置于一側(cè)帶有進(jìn)氣口的透明聚乙烯塑料盒中，再置于37℃培養(yǎng)箱中，2% IF麻醉機(jī)提供，其中IF的載氣為空氣和5%CO2的混合氣體，氣體由密閉管道的進(jìn)氣口通入，使裝有96孔板的盒子中的細(xì)胞暴露于2%IF中，而對(duì)照組則通入空氣+5%CO2正常培養(yǎng)，處理6 h后棄培養(yǎng)上清，對(duì)照組和IF組加入DMEM培養(yǎng)基，IF+30 VT、IF+50 VT和IF+100 VT組分別加入30、50、100 mg/L的VT，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，每孔加入15 μl的MTT(終濃度為5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，棄上清培養(yǎng)液，加入200 μl的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻10 min，酶標(biāo)儀上540 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔的吸光度值，以與對(duì)照組吸光度值的百分比表示細(xì)胞活性。每個(gè)樣設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分組及處理方式見1.3，取培養(yǎng)至第8天經(jīng)NSE免疫組化鑒定的海馬神經(jīng)細(xì)胞，以1×105個(gè)/ml的密度接種于6 cm培養(yǎng)皿中，每皿5 ml。采用MTT比色法體外對(duì)各組進(jìn)行處理，48 h后PBS清洗細(xì)胞3次，加入0.25%胰酶，吹打至懸浮狀態(tài)，每皿加入100 μl緩沖液、5 μl Annexin Ⅴ-FITC及5 μl 0.5 mg/L PI，避光4℃靜置15 min，于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況。統(tǒng)計(jì)右下和右上象限的數(shù)值之和即為細(xì)胞凋亡的比例(早期凋亡與晚期凋亡之和)。每個(gè)樣設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7ELISA檢測(cè)Aβ1～42、TNF-α和INF-γ的含量實(shí)驗(yàn)分組及處理方式見1.2，將大鼠處死后立即取腦，冰上分離大鼠的雙側(cè)海馬，放入凍存管置于液氮中，凍存48 h后稱取各組組織100 mg，置于含2%烷基硫酸鈉和50 mmol/L蛋白酶抑制劑的PBS中，4℃、12 000 r/min離心20 min后取上清液，嚴(yán)格參照ELISA檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書，分別進(jìn)行Aβ1～42、TNF-α和INF-γ的含量檢測(cè)，將稀釋的樣品加樣并蓋上封板膜，輕搖后在37℃反應(yīng)60 min，洗板5次，分別加入顯色液A和B，37℃下顯色10 min后加入終止液，10 min內(nèi)讀取OD值，據(jù)此繪制濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所測(cè)OD值找出標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的樣本濃度，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每個(gè)樣設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用成組t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較經(jīng)單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1原代海馬神經(jīng)細(xì)胞的鑒定結(jié)果鏡下觀察顯示海馬神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且所有細(xì)胞均胞體豐滿。NSE的免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞的胞質(zhì)和部分突起為棕黃色著色，表明本培養(yǎng)方法可得到純度較高的新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞。見圖1。

2.2VT對(duì) IF作用下海馬神經(jīng)細(xì)胞活性的影響與空白對(duì)照組(97.67±1.20)比較，IF組細(xì)胞活性(60.33±3.28)顯著降低(t=10.681，P=0.000)。與IF組比較，IF+30 VT、IF+50 VT、IF+100 VT組(73.67±3.18、86.67±2.03)、70.33±1.20)顯著增加(t=2.917，6.825，2.860；P=0.043，0.002，0.046)。

2.3VT對(duì) IF作用下海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡能力的影響與空白對(duì)照組(9.41±0.30)%比較， IF組細(xì)胞凋亡率(42.54±0.75)%顯著增加(t=40.962，P=0.000)。與IF組比較， IF+30 VT、IF+50 VT、IF+100 VT組〔(31.00±0.57)%、(12.34±0.87)%、(23.70±0.90)%〕顯著降低(t=12.214，26.210，15.968；P=0.000，0.000 1，0.000)。

2.4VT對(duì) IF作用下海馬組織勻漿中Aβ1～42，TNF-α和INF-γ含量的影響與空白對(duì)照組Aβ1～42、TNF-α和INF-γ含量(756.91±12.24，0.85±0.02，72.54±1.29)比較，IF組(1 276.00±14.37，2.15±0.08，97.91±1.50)均顯著上升(t=27.512，15.596，12.812；均P=0.000)。與IF組相比， IF+30 VT、IF+50 VT、IF+100 VT組Aβ1～42含量(916.81±44.17，tIF+30 VT=7.736，PIF+30 VT=0.002；703.71±12.24，tIF+50 VT=30.316，PIF+50 VT=0.000 1；1 053.00±28.91，tIF+100 VT=6.918，PIF+100 VT=0.002)、TNF-α(1.82±0.04，tIF+30 VT=3.654，PIF+30 VT=0.022； 1.52±0.02，tIF+50 VT=7.634，PIF+50 VT=0.002；1.57±0.03，tIF+100 VT=6.586，PIF+100 VT=0.003)和INF-γ(81.67±1.67，tIF+30 VT=7.234，PIF+30 VT=0.002；71.77±0.91，tIF+50 VT=14.907，PIF+50 VT=0.000；75.68±1.86，tIF+100 VT=9.306，PIF+100 VT=0.001)的含量均顯著降低。

3　討　論

研究顯示，吸入3% IF的大鼠其神經(jīng)細(xì)胞受到明顯損傷，且學(xué)習(xí)記憶能力也受到了顯著影響，其機(jī)制可能與IF可引起炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激或細(xì)胞凋亡等有關(guān)〔8〕。VT為黃酮碳苷類化合物，具有抗感染、抗氧化、抗凋亡等藥理作用，有一定的神經(jīng)保護(hù)和抗記憶損傷作用〔9〕。

研究顯示老年大鼠在高濃度吸入麻醉藥物后，可使其神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡、導(dǎo)致其認(rèn)知功能障礙，而許多中藥可有效地改善該過(guò)程，如姜黃素可改善高濃度吸入麻醉藥物所致的老年大鼠學(xué)習(xí)記憶力損害〔10〕、紅景天苷可改善吸入麻醉藥所致的阿爾茨海默病大鼠的認(rèn)知功能障礙〔11〕、竹葉黃酮可刺激神經(jīng)細(xì)胞的突觸生長(zhǎng)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn)VT也能顯著抑制 IF所致的海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，增加細(xì)胞的活性，提示 VT可能有潛力用于POCD的防治。

研究認(rèn)為Aβ的生成、聚集和沉積是認(rèn)知功能損害相關(guān)疾病如POCD等的重要病理學(xué)基礎(chǔ)〔13〕。Aβ1～42對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，能使Aβ纖維聚集而產(chǎn)生老年斑，對(duì)人的認(rèn)知功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響〔14〕。已有研究顯示，2% IF處理人膠質(zhì)瘤細(xì)胞可顯著促進(jìn)Aβ的生成〔15〕。本研究表明2% IF處理大鼠，使大鼠海馬組織勻漿中Aβ1～42含量顯著增加，而不同濃度的VT均可顯著抑制Aβ1～42含量，說(shuō)明VT可顯著改善 IF所致大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷，該過(guò)程可能與抑制Aβ1～42的生成有關(guān)。

研究報(bào)道還認(rèn)為POCD和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)間存在相關(guān)性，如過(guò)度釋放的促炎因子可能使IF誘導(dǎo)大鼠發(fā)生POCD〔16〕。炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的TNF-α和IFN-γ能降低胰島素降解酶的表達(dá)水平，使小膠質(zhì)細(xì)胞的Aβ1～42降解能力顯著降低〔17〕。本研究結(jié)果表明VT可通過(guò)增強(qiáng)大鼠抗感染能力、降低TNF-α和IFN-γ的含量而抑制IF所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷。

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